COME. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Recentemente demostrouse que o fungo ascomiceto Ilyonectria crassa é capaz de infectar tubérculos de pataca. Este traballo é o primeiro en analizar as características biolóxicas e a resistencia a algúns funxicidas da cepa I. crassa illada das patacas. As secuencias de rexións específicas da especie da cepa "pataca" coincidiron coas obtidas anteriormente para fungos illados das raíces de narciso, ginseng, álice e faia, bulbos de lirio e follas de tulipán. Ao parecer, moitas plantas silvestres e de xardín poden ser reservas de I. crassa. A cepa investigada infectou rodajas de tomate e pataca, pero non infectou a froita de tomate enteira nin o tubérculo de pataca intacto. Isto demostra que I. crassa é un parásito da ferida. A avaliación da resistencia ao fludioxonil, difenoconazol e azoxistrobina nun medio nutritivo mostrou unha alta eficacia destes medicamentos.
O indicador EC50 (a concentración de funxicida, que diminúe dúas veces a taxa de crecemento radial da colonia en relación ao control non funxicida) foi igual a 2; 0.4 e 7.4 mg / l, respectivamente. A posibilidade do desenvolvemento dunha enfermidade causada por I. crassa debe terse en conta á hora de avaliar fitopatolóxicamente os tubérculos da pataca e desenvolver medidas fitosanitarias.
O desenvolvemento de microorganismos fitopatóxenos leva a altas perdas en todas as fases de cultivo e almacenamento de patacas. Á hora de planificar medidas de protección, como regra, tense en conta axentes patóxenos coñecidos, como especies dos xéneros Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, etc. Non obstante, nos últimos anos apareceron máis e máis informes. sobre a aparición de novos microorganismos fitopatóxenos nas patacas. A súa bioloxía está mal estudada, descoñécese a eficacia dos funxicidas empregados nas patacas en relación con eles, non se desenvolveron métodos de diagnóstico. Cun desenvolvemento masivo, son capaces de causar danos significativos na colleita de pataca. Un destes microorganismos é o fungo ascomiceto Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, descuberto por primeira vez polos autores sobre tubérculos de pataca (Chudinova et al., 2019).
Este traballo presenta os resultados da análise da cepa de I. crassa illada do tubérculo da pataca. Estudáronse a morfoloxía das colonias e estruturas miceliais de I. crassa, secuencias de nucleótidos de rexións de ADN específicas de especies, virulencia a patacas e tomates e resistencia a algúns funxicidas populares.
Materiais e métodos
Usamos a cepa I. crassa 18KSuPT2 illada en 2018 do tubérculo de pataca infectado cultivado na rexión de Kostroma. O tubérculo viuse afectado pola podremia seca cunha cavidade cuberta de micelio marrón claro. Empregando unha agulla de disección estéril, o micelio fúngico transferiuse a unha placa de Petri cun medio de agar (mosto de cervexa ao 10%, ágar ao 1.5%, penicilina 1000 U / ml). As placas incubáronse na escuridade a 24 ° C.
Utilizáronse un microscopio óptico Leica DM2500 cunha cámara dixital ICC50 HD e un microscopio binocular Leica M80 cunha cámara dixital IC80HD (Leica Microsystems, Alemaña) para fotografar, avaliar o tamaño e a morfoloxía das esporas e dos órganos das esporas.
Para illar o ADN, o micelio fúngico cultivouse en medio de chícharos líquido, despois conxelouse en nitróxeno líquido, homoxeneizouse, incubouse en tampón CTAB, purificouse con cloroformo e lavouse dúas veces cun 2% de alcohol.
O método de extracción de ADN descríbese en detalle no artigo de Kutuzova et al. (2017).
Para determinar as especies por métodos moleculares e comparar con outras cepas de I. crassa coñecidas, a PCR levouse a cabo con cebadores que permiten a amplificación de rexións de ADN específicas da especie: ITS1-5,8S-ITS2 (cebadores ITS5 / ITS4, White et al., 1990), rexións xénicas b-tubulina (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) e factor de alargamento de tradución 1α (tef1α) (cebadores EF1-728F / EF1-986R, Carbone e Kohn, 1999). Os xampóns da lonxitude desexada extraéronse do xel usando o kit Evrogen CleanUp. As rexións amplificadas secuenciáronse empregando o BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, EUA) nun secuenciador automatizado Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, EUA). As secuencias de nucleótidos resultantes empregáronse para buscar unha coincidencia na base de datos GenBank do Centro Nacional de Información sobre Biotecnoloxía dos Estados Unidos (NCBI). A análise filoxenética realizouse usando o programa MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
A determinación da virulencia levouse a cabo en froitos verdes enteiros de tomate de gran froito (variedade Dubrava) e tubérculos de pataca (variedade Gala). Ademais, usáronse franxas dos mesmos froitos e tubérculos para simular danos en froitas e tubérculos danados. Láminas de tubérculos colocáronse en cámaras húmidas, que eran placas de Petri con papel de filtro húmido na parte inferior. Colocouse unha diapositiva sobre o papel, sobre a que, á súa vez, colocáronse rodajas de tubérculos ou froitas. Tamén se colocaron tubérculos e froitas enteiros en recipientes con papel de filtro húmido na parte inferior. No centro da porción (ou na superficie intacta do tubérculo ou froito), colocouse un anaco de agar (5 × 5 mm) con hifas fúngicas despois de 5 días de medrar en agar de mosto.
A avaliación da resistencia de cepas de fungos a funxicidas levouse a cabo en condicións de laboratorio en medio nutritivo de agar. Estudamos a susceptibilidade ás drogas funxicidas Maxim, KS (principio activo fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxistrobina 250 g / l), Scor, EC (difenoconazol 250 g / l) (Catálogo estatal ..., 2020 ). A avaliación levouse a cabo en placas de Petri nun medio agar-mosto coa adición dos fármacos estudados a unha concentración da sustancia activa de 0.1; un; 1 ppm (mg / L) (para fludioxonil e difenoconazol), 10; dez; 1 ppm (para azoxistrobina) e en medios sen funxicida (control). O funxicida engadiuse ao medio fundido arrefriado a 10 ° C, despois de que o medio se vertese nas placas de Petri. Un bloque de agar con micelio fúngico colocouse no centro dunha placa de Petri e cultivouse a unha temperatura de 100 ° C na escuridade. Despois de 60 días de incubación, os diámetros das colonias medíronse en dúas direccións mutuamente perpendiculares; promediaronse os resultados das medicións para cada colonia. Os experimentos realizáronse por triplicado. Baseado nos resultados das análises, calculouse o EC24, igual á concentración do funxicida, que reduciu á metade a taxa de crecemento radial da colonia en relación co control libre de funxicidas.
Resultados e discusión
Nas placas de Petri con agar de mosto, o fungo formou colonias con micelio floculente branco. O medio baixo o micelio volveuse marrón avermellado. Cando o medio se seca, o fungo formou esporas de dous tipos en conidióforos únicos e agregados en pequenos esporodocios. Os macroconidios son alargados, cilíndricos, dun a tres tabiques, cunha lonxitude media de 27.2 µm cun rango de valores de 23.2 a 32.2 µm, con ancho ata 4.9 µm (Fig. 1). A lonxitude media dos microconidios é de 14.3 µm cun rango de valores de 10.3 a 18.1 µm e o ancho é de ata 4.0 µm. Todos os caracteres macro e micromorfolóxicos encaixan no rango de variación da especie Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
As secuencias das rexións de ADN específicas da especie (ITS, b-tubulina, TEF 1α) coincidiron completamente coas secuencias das cepas de I. crassa que estudamos anteriormente (Chudinova et al., 2019, táboa 1). Para estudar a prevalencia de I. crassa noutras rexións e analizar o espectro de cultivos afectados, analizáronse secuencias de ADN similares na base de datos GenBank (táboa 1). A superposición foi do 86 ao 100%. As secuencias das tres rexións de ADN da cepa I. patata "crassa" eran idénticas ás secuencias das cepas illadas das raíces do bulbo de lirio e do narciso nos Países Baixos e da raíz do ginseng en Canadá. Non puidemos atopar outras cepas de I. crassa con tres secuencias análogas analizadas en bases de datos abertas. Non obstante, a análise das secuencias ITS e b-tubulina depositadas mostrou a presenza de I. crassa nas follas de tulipa no Reino Unido. Os fungos cunha secuencia ITS semellante identificáronse ao analizar a micobiota de raíces de álamo aspen en Canadá e raíces de faia en Italia e tubérculos de pataca en Arabia Saudita (táboa 1). Os resultados deste estudo mostran que I. crassa ten unha distribución global e é capaz de infectar varias especies de plantas.
Ao determinar a patoxenicidade en rodajas de tomate e pataca o 5o día, o diámetro da lesión alcanzou os 1.5 cm. Neste caso, a cepa investigada non infectou a tomate enteira e o tubérculo de pataca intacto. Non obstante, os sépalos víronse afectados no tomate. Para excluír a posibilidade de contaminación, un illado de fungos do micelio desenvolvido nunha porción de tubérculo de pataca foi illado nun cultivo puro. Foi completamente idéntico á cepa nai. Ao parecer, I. crassa é un parásito da ferida.
O tratamento previo á plantación de tubérculos de sementes con funxicidas reduce o desenvolvemento de enfermidades nas plantas durante a estación de crecemento. Para a selección de funxicidas efectivos, é importante avaliar cales son eficaces contra I. сrassa. O traballo estudou as substancias activas xeneralizadas dos funxicidas: fludioxonil, azoxistrobina, difenoconazol. O fludioxonil está formulado en varias mesturas empregadas para preparar sementes e tubérculos antes de plantar. Fludioxonil (Maxim) tamén se usa para tratar tubérculos de sementes antes do seu almacenamento. O difenoconazol e a azoxistrobina tamén se inclúen nunha serie de preparacións usadas para procesar o material de sementes, así como en preparacións destinadas ao procesamento de plantas vexetativas (catálogo estatal ..., 2020).
A taxa de crecemento de I. crassa estudouse en medios (Fig. 2) con diferentes concentracións de substancias activas: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxistrobina (EC50 = 4 ppm) e difenoconazol (EC50 = 7.4 ppm) (Táboa 2 ). Estas preparacións pódense considerar moi eficaces contra I. crassa, xa que o seu EC50 é significativamente inferior á concentración recomendada do preparado no fluído de traballo usado para tratar tubérculos. Segundo o Catálogo estatal ... (2020), a concentración de fludioxonil no líquido para tratar tubérculos de pataca é de 500 a 1000 ppm, azoxistrobina (no líquido para tratar o fondo do surco) - 3750-9375 ppm, difenoconazol (no líquido para o tratamento de plantas vexetativas) - 187.5– 625 ppm.
Táboa 1. Semellanza de secuencias de secuencias específicas de especies de cepa 18KSuPT2 e cepas de Ilyonectria crassa dispoñibles na base de datos de Genbank
Cepo | Planta hóspede, lugar de excreción | Números de secuencia depositados en GenBank, porcentaxe de similitudes | Ligazón | ||
A SÚA | β-tubulina | TEF 1α | |||
17KSPT1 e 18KSuPT2 | Tubérculo da pataca, rexión de Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, este traballo |
CBS 158/31 | Raíces de narciso, Países Baixos | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Bulbo de lirio, Países Baixos | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Raíz de ginseng, Canadá | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulip leaf, Reino Unido | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Aspen roots, Canadá | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Faia, Italia | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Envío directo |
KAUF19 | Tubérculo de pataca, Arabia Saudita | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = non depositado
Táboa 2. Resistencia de Ilyonectria crassa a funxicidas
(sustancia activa) | EC50, ppm | ||||
Día 3 | Día 5 | Día 7 | |||
Controlar | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxistrobina) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenoconazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
No noso traballo, as cepas de I. crassa foron illadas de tubérculos de pataca nas rexións de Kostroma e Moscova (Chudinova et al., 2019). Unha alta proporción de cepas de fungos con secuencias ITS idénticas a I. crassa revelouse na análise da micobiota de tubérculos de pataca en Arabia Saudita (Gashgari e Gherbawy, 2013). Ao parecer, I. crassa non é tan raro nas patacas como podería parecer. Nos nosos experimentos demostrouse que o fungo podía infectar os froitos do tomate danados. Pola literatura sábese que I. crassa é capaz de desenvolverse saprotróficamente no chan (Moll et al., 2016), así como afectar a unha variedade de plantas, incluso taxonimicamente distantes como narcisos, lirios, ginseng, álamo temblón, e faia (táboa 1). un). Ao parecer, moitas plantas silvestres e de xardín poden ser reservas de I. crassa. O anterior amosa que ao desenvolver medidas de protección é necesario ter en conta a posibilidade de afectar aos tubérculos de pataca con este fungo. Os preparados xeneralizados para o tratamento de tubérculos de pataca que conteñen fludioxonil, azoxistrobina e difenoconazol demostraron unha alta eficacia funxicida contra I. crassa.
Este traballo foi apoiado pola Fundación Rusa para a Investigación Básica (subvención núm. 20-016-00139).
O artigo publicouse na revista "Buletin de protección das plantas", 2020, 103 (3)