D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
O fungo fitopatóxeno Colletotrichum coccodes causa enfermidades perigosas en patacas e tomates coñecidas como mancha negra de antracnose e tubérculos. Por características morfolóxicas, adoitan ser difíciles de distinguir das enfermidades causadas por outros microorganismos; nos froitos de tomate verde, a enfermidade pode ser asintomática, manifestándose só nos froitos vermellos maduros. Para un diagnóstico rápido e preciso do patóxeno, ofrécese un sistema de proba de PCR en tempo real. Para desenvolver un sistema de proba, determinouse a secuencia de nucleótidos do xene glicerol trifosfato deshidroxenase de cepas de 45 C. coccodes illadas de tubérculos de pataca en diferentes rexións de Rusia.
Baseándose nos resultados obtidos e na análise de secuencias similares doutras especies dispoñibles na base de datos GenBank, deseñáronse cebadores específicos de especies e sonda para C. coccodes. Para comprobar a especificidade do sistema de proba creado, realizouse PCR con ADN illado de cultivos puros de 15 especies diferentes de fungos parasitos e saprotróficos asociados a plantas de tomate e pataca (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). A presenza de ADN de Colletotrichum coccodes determinouse nun ciclo limiar de 20 a 27, mentres que outras especies foron detectadas despois de 40 ciclos ou non foron detectadas. O sistema de proba permite detectar de forma fiable concentracións de ADN de C. coccodes superiores a 0.01 ng / mm3 na mestura de PCR analizada. Usando o sistema de proba desenvolvido, investigouse a presenza de C. coccodes en follas de tomate con síntomas de enfermidades fúngicas e en tubérculos de pataca sen síntomas externos da enfermidade. Follas con síntomas de infección por fungos recolléronse de dous campos diferentes no Territorio de Krasnodar, tubérculos - de campos das rexións de Kostroma, Moscova, Kaluga, Nizhny Novgorod. Atopouse unha folla de tomate que contiña ADN de C. coccodes no Territorio de Krasnodar; detectouse unha presenza significativa de ADN deste patóxeno en 5 mostras de tubérculos cultivados nas rexións de Kostroma, Moscova e Kaluga.
Introdución
Os fungos do xénero Colletotrichum son fitopatóxenos perigosos que afectan aos cereais, verduras, herbas, froitas perennes e plantas de bagas. Unha das especies omnipresentes deste xénero, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, é o axente causante da antracnose e da mancha negra de patacas e tomates, e causa enfermidades doutras plantas da familia das Solanáceas, incl. herbas daniñas (Dillard, 1992). C. coccodes afecta a todas as partes subterráneas da planta, bases do talo, follas e froitos (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Na casca dos tubérculos de pataca infectados obsérvase o desenvolvemento de manchas grises con bordos indistintamente pronunciados, sobre os que se ven claramente puntos negros de esporulación e microsclerotia. Durante o almacenamento, pódense formar úlceras con contido suavizado na polpa dos tubérculos, é dicir. a enfermidade entra na fase de antracnose, que, con todo, é extremadamente rara.
Ao mesmo tempo, os síntomas da antracnose (úlceras na pel con pequenos puntos negros) son típicos dos froitos do tomate. Nas follas, os síntomas de C. coccodes aparecen como manchas marróns escuras, normalmente bordeadas por tecido amarelo (Johnson, 1994).
O desenvolvemento da mancha negra nos tubérculos estraga o seu aspecto, que se manifesta especialmente cando se venden patacas de pel vermella lavadas. A exfoliación da casca leva a un exceso de evaporación e a un aumento das perdas de almacenamento (Hunger, McIntyre, 1979). O dano a outros órganos vexetais leva a producir perdas, que se observaron tanto en terreo aberto como pechado (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). As enfermidades causadas por C. coccodes son comúns en case todas as rexións produtoras de patacas do mundo, incluída Rusia (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). O control destas enfermidades é difícil debido á insuficiente eficacia dos funxicidas existentes contra C. coccodes e á falta de variedades resistentes (Read, Hide, 1995).
O C. coccodes inoculum pode persistir en tubérculos de sementes (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), sementes de tomate (Ben-Daniel et al., 2010), sobreviven durante moito tempo no chan, sobre restos vexetais (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) e en maleza (Raid, Pennypacker, 1987). Os traballos de varios autores (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) demostraron que o desenvolvemento da enfermidade en patacas e tomates depende en gran medida da presenza de inóculo na semente e chan. Polo tanto, para minimizar as perdas pola enfermidade, é necesario diagnosticar (incluíndo cuantitativamente) os propágulos do fungo no material da semente, no chan, nos tubérculos de pataca e nas sementes de tomate colocadas para o seu almacenamento. O diagnóstico morfolóxico no solo e no material vexetal só pode levarse a cabo coa presenza de microsclerotios, que, con todo, tamén se atopan noutros tipos de fungos.
Os síntomas dos tubérculos son moi similares á costra de prata causada polo fungo Helminthosporium solani. O illamento de Colletotrichum coccodes e Helminthosporium solani nun cultivo puro é bastante difícil e leva moito tempo debido ao lento crecemento dun medio nutritivo. Para identificar rapidamente os coccodes de Colletotrichum, é necesario empregar métodos de diagnóstico instrumentais. O método máis conveniente é a reacción en cadea da polimerase (PCR) e a súa modificación: a PCR en tempo real. Actualmente, en Europa e Estados Unidos úsase un sistema de proba desenvolvido por investigadores británicos (Cullen et al., 2002) para a rexión ITS1 do ADNr. O seu uso mostrou bos resultados na análise de illados rusos (Belov et al, 2018). Non obstante, C. coccodes é moi variable e a súa detección a partir dunha única secuencia de ADN pode levar a resultados falsos negativos. Para un diagnóstico máis fiable, é necesario analizar varias secuencias de ADN específicas de especies, en relación coas que desenvolvemos un sistema de proba orixinal que nos permite identificar C. coccodes pola secuencia do xene gliceraldehído-3-fosfato deshidroxenase.
Materiais e métodos
Para avaliar a eficacia e especificidade dos sistemas de proba creados, empregamos cultivos puros de 15 especies de fungos illados polos autores a partir de mostras enfermas de follas e froitos de tomate, tubérculos de pataca (táboa 1). Para o illamento tomáronse os órganos das plantas con síntomas de infección por fungos, non máis dun órgano por arbusto.
Unha porción de tubérculo cunha casca, unha porción de froita de tomate e unha folla afectada colocáronse baixo un microscopio binocular, despois do cal o micelio, as esporas ou un anaco de tecido foron transferidos a un medio de agar (agar de mosto) nunha placa de Petri cunha agulla de disección afiada. Os illados almacenáronse en pendentes de agar en tubos de ensaio a 4 ° C.
As mostras de follas de tomate con síntomas de enfermidades fúnxicas, destinadas a análise, inmediatamente despois da recollida (no campo) colocáronse nun alcohol etílico ao 70% no que se almacenaron ata o illamento do ADN. Os tubérculos de pataca entregáronse ao laboratorio, peláronse (peza de 2 × 1 cm) deles e conxeláronse a –20 ° С. Almacenado conxelado ata o illamento do ADN.
Cultivos puros de fungos para o illamento do ADN cultiváronse en medio chícharo líquido. Eliminouse o micelio do fungo do medio líquido, secouse sobre papel de filtro, conxelouse en nitróxeno líquido, homoxeneizouse, incubouse en tampón CTAB, purificouse con cloroformo, precipitouse cunha mestura de isopropanol e acetato de potasio 0.5 M, lavouse dúas veces cun 2% de alcohol. O ADN resultante disolveuse en auga desionizada e almacenouse a –70 ° С (Kutuzova et al., 20). Mediuse a concentración de ADN empregando un kit de cuantificación de ADN HS para ADN de dobre cadea en Qubit 2017 (Qiagen, Alemaña). As mostras alcohólicas e conxeladas trituráronse en nitróxeno líquido e despois levouse a cabo a extracción de ADN como se describiu anteriormente (para o micelio de cultivos de fungos puros).
Táboa 1. Orixe das cepas de fungos usadas
Nome do cogomelo | Planta, órgano | Lugar de selección |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | tubérculo de pataca | Rexión de Kostroma, tubérculos de pataca da primeira xeración de campo, cultivar Red Scarlett |
Colletotrichum cocodes 4 | folla de pataca | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | tubérculo de pataca | Rexión de Magadan, pos. Tenda de campaña, tubérculo de pataca |
Cladosporium fulvum | folla de tomate | Rexión de Moscova, tomate de froitos grandes |
Alternaria tomatophila | froita de tomate | entregado polo persoal do laboratorio de micoloxía e fitopatoloxía do Instituto de Investigación de Protección Vexetal de toda Rusia |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | froita de tomate | Territorio de Krasnodar, distrito de Krymsky, grao Cream |
Fusarium oxysporum | raíz de trigo | Rexión de Moscú |
A PCR realizouse nun amplificador DTprime (ADN-Technology). Para a PCR, empregáronse cebadores orixinais e unha sonda para a rexión específica da especie do xene glicerol trifosfato deshidroxenase: cebador directo Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, cebador inverso Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). Os cebadores amplifican unha rexión de 213 pb.
A reacción levou 50 ng de ADN total (ao analizar follas e tubérculos) e 10 ng (ao analizar ADN de cultivos de fungos puros). A mestura de reacción (35 μl) separouse por unha capa de parafina en dúas partes: a inferior (20 μl) contiña 2 μl de tampón de reacción 10 × (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM de cada trifosfato de desoxinucleótido, 7 pmol de cada cebador e 4 pmol dunha sonda fluorescente hidrolizable; o superior contiña 1 μl de tampón 10 × PCR e 1 U de polimerasa Taq.
A separación da mestura con parafina permite gardar os tubos durante moito tempo a unha temperatura de 5 ° C e proporcionar un arranque en quente para a PCR despois de quentalos durante 10 minutos a unha temperatura superior a 80 ° C. A PCR realizouse segundo o seguinte programa: 94.0 ° C - 90 s (1 ciclo); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 ciclos); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 ciclos); 10.0 ° C - almacenamento.
Resultados e discusión
As secuencias do xene glicerol trifosfato deshidroxenase determináronse en 45 cepas illadas de follas, talos, tubérculos de pataca e froitos de tomate (Kutuzova, 2018) en diferentes rexións de Rusia. As secuencias estudadas de todas as cepas dividíronse en 2 grupos que se diferencian en dous nucleótidos. As secuencias de nucleótidos de representantes de ambos grupos baixo os números KY496634 e KY496635 están depositadas en GenBank.
Os cebadores coc70gdf, coc280gdr e a sonda cocgdz deseñados na súa base foron comprobados usando o programa BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) en todas as secuencias do xene glicerol trifosfato deshidroxenase de especies do xénero Colletotrichum e outros organismos dispoñibles na base de datos GenBank.
Non se atoparon rexións de ADN doutros organismos altamente homólogos a cebadores e sondas.
Comprobouse a sensibilidade do sistema de proba empregando mostras con diferentes concentracións de ADN de C. coccodes, ADN dunha folla de pataca infectada con antracnose (recollida en 2017 en Mari El, variedade Red Scarlett) e casca de tubérculos afectados por mancha negra (recollida na rexión de Kostroma, variedade Red Scarlett, táboa 2). Para confirmar a presenza de ADN en tubérculos e follas de pataca, illáronse as cepas de C. coccodes en cultivos puros.
Os resultados da análise de sensibilidade do sistema de proba mostran que se pode usar para diagnosticar con éxito a presenza de ADN de C. coccodes nunha mostra se o seu contido total na mestura de PCR é superior a 0.05 ng. Isto é bastante suficiente para a detección, xa que unha esclerotia contén en promedio 0.131 ng e unha espora contén aproximadamente 0.04 ng de ADN (Cullen et al., 2002). O sistema de proba desenvolvido polo grupo inglés (Cullen et al., 2002) mostrou unha sensibilidade similar (ciclo limiar 34 a 0.05 ng de ADN e 37 a 0.005 ng).
A análise de mostras naturais que conteñen C. coccodes en todos os casos permitiu revelar de xeito fiable a súa presenza na mostra (táboa 2). O método proposto para o illamento do ADN tamén foi aplicable para a análise de mostras de plantas naturais.
Táboa 2. Determinación da sensibilidade do sistema de proba proposto para a identificación de coccodos Colletotrichum para PCR en tempo real
Mostra | A cantidade de ADN da mostra *, ng | Ciclo limiar | C. detección de coccodes |
---|---|---|---|
Micelio Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Casca de tubérculo 1 | 50 | 32 | + |
Casca de tubérculo 2 | 50 | 30 | + |
Casca de tubérculo 3 | 50 | 31.5 | + |
Folla de pataca | 50 | 29.5 | + |
Nota. * Nunha mestura de produtos de PCR.
A especificidade do sistema de proba probouse en mostras de ADN extraídas de 15 especies de fungos. Todas as cepas de fungos foron illadas polos autores de froitas e follas saudables e afectadas de tomate, tubérculos de pataca; illouse unha cepa da raíz de trigo (táboa 1). Entre as illadas da superficie do froito, tamén hai especies que non son patóxenas para o tomate (por exemplo, Phellinus ferrugineovelutinus).
Os estudos demostraron que o ADN de C. coccodes detectouse nun ciclo limiar de 20 a 27, mentres que outras especies fúnxicas non foron detectadas nin deron un sinal despois do ciclo 40, o que pode atribuírse a un efecto de ruído inespecífico (táboa 3).
Táboa 3. Comprobación do sistema de proba de varios tipos de cogomelos
Nome do cogomelo | Ciclo limiar |
Colletotrichum cocodes 1 | 20.9 |
C. cocodes 2 | 22.6 |
C. cocodes 3 | 23 |
C. cocodes 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineolutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium NS. | > 40 |
Nota. * A cantidade de ADN en todas as mostras foi de 10 ng.
O sistema de proba desenvolvido utilizouse para identificar C. coccodes en mostras de follas de tomate con síntomas de patóxenos necrótrofos e tubérculos de pataca de sementes sen síntomas visibles. Para o estudo tomamos tubérculos de sementes de diferentes variedades cultivadas nas rexións de Kostroma, Moscova, Kaluga, Nizhny Novgorod. A presenza de ADN de C. coccodes considerouse significativa nas mostras, en cuxa análise o ciclo limiar non superou os 35. Este valor limiar seleccionouse en base á determinación fiable de 0.05 ng de ADN de C. coccodes (ciclo limiar 33.5, táboa 2) e o feito de que en ciclos limiares superiores a 40, diagnosticouse ADN inespecífico doutras especies de fungos. Con este enfoque, detectouse a presenza significativa de ADN de C. coccodes en 5 mostras de tubérculos cultivados nas rexións de Kostroma, Moscova, Kaluga e nunha folla de tomate da rexión de Yeisk na rexión de Krasnodar (táboas 4, 5).
Táboa 4. Detección de coccodes Colletotrichum en tubérculos de pataca *
Número de mostra | Variedade de pataca | Lugar de crecemento | C. detección de coccodes | Ciclo limiar |
---|---|---|---|---|
1 | Escarlatina vermella | Rexión de Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Rexión de Moscú | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky cedo | Rexión de Moscú | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | rexión de Kaluga. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantasía | rexión de Kaluga. | - | |
15 | Gala | rexión de Nizhny Novgorod. | - | |
16 | - |
Nota. * A cantidade de ADN en todas as mostras foi de 50 ng.
Táboa 5. Detección de coccodes Colletotrichum en follas de tomate *
Número de mostra | Lugar de crecemento | C. detección de coccodes | Ciclo limiar |
---|---|---|---|
1 | Territorio de Krasnodar, distrito de Crimea | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Territorio de Krasnodar, distrito de Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* A cantidade de ADN en todas as mostras foi de 50 ng.
O sistema de proba creado por nós non é inferior ao desenvolvido por investigadores británicos (Cullen et al., 2002) en sensibilidade e especificidade e é adecuado para a análise de mostras de plantas. A súa aplicación para a análise de tubérculos de sementes permitiu identificar o ADN de C. coccodes en tubérculos sen signos externos de dano e analizar con éxito a infección das follas.
Ata a data, en Rusia non se realizou ningunha análise de tubérculos de pataca para a infestación de C. coccodes. O noso primeiro estudo mostrou que de 16 tubérculos de sementes probados cultivados en diferentes rexións da Federación Rusa, 5 conteñen C. coccodes. Isto demostra que a mancha negra dos tubérculos da pataca é unha enfermidade común da pataca en Rusia e subestímase o seu papel na redución do volume e a calidade do cultivo de pataca.
A análise de follas de tomate revelou unha presenza significativa de ADN de C. coccodes nunha folla do distrito Yeisk do Territorio de Krasnodar. Anteriormente, ao examinar campos de tomate no sur de Rusia mediante o sistema de proba británico (Cullen et al., 2002), atopáronse follas que contiñan C. coccodes e nalgúns campos atopouse unha alta proporción de follas infectadas con C. coccodes (Belov et al., 2018). Nos territorios de Krasnodar e Primorsky, na rexión de Moscova, atopamos froitas de tomate, das que conseguimos illar cultivos puros de C. coccodes. É posible que C. coccodes estea moito máis estendido no tomate en Rusia do que se cre agora e tamén se subestima a súa nocividade.
Así, ata a data acumulouse suficiente información sobre a distribución xeneralizada de C. coccodes en patacas e tomates.
Para comprender mellor o papel deste fungo no desenvolvemento de enfermidades da pataca e o tomate, é necesario controlar a súa prevalencia en Rusia, estudar o papel das infeccións do solo e das sementes e o papel da mancha negra nas perdas durante o almacenamento. O uso de diagnósticos PCR pode facilitar significativamente este traballo e o uso simultáneo de ambos sistemas de proba aumentará significativamente a precisión da análise.
Este traballo contou co apoio da subvención da Fundación científica rusa número 18-76-00009.
O artigo publicouse na revista "Mycology and Phytopathology" (volume 54, no 1, 2020).