S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Introdución
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, o axente causante do tizón tardío, a enfermidade máis importante economicamente da pataca e do tomate, atrae a atención de investigadores de diferentes países durante máis dun século e medio. Aparecido de súpeto en Europa a mediados do século XIX, causou unha epidemia de patacas que permaneceu na memoria de moitas xeracións.
Ata agora, adoitaba denominarse o "cogomelo da fame irlandesa". Case cen anos despois das primeiras epidemias descubríronse especies de patacas salvaxes mexicanas resistentes ao tizón tardío, desenvolvéronse métodos para cruzalas con patacas cultivadas (Muller, 1935) e obtivéronse as primeiras variedades resistentes ao tizón tardío (Pushkarev, 1937). Non obstante, pouco despois do comezo do seu cultivo comercial, acumuláronse razas do patóxeno do tizón tardío que eran virulentas para as variedades resistentes. e a introdución de novos xenes de resistencia de patacas salvaxes mexicanas nas variedades comezaron a perder eficacia rapidamente.
Os fracasos no uso da resistencia monoxénica (vertical) obrigaron aos criadores a buscar formas máis complexas de explotar a resistencia polixénica (horizontal) inespecífica. Nos últimos anos, as razas moi agresivas comezaron a acumularse en poboacións individuais do parasito, causando erosión incluso de resistencia inespecífica. A chegada de cepas resistentes aos funxicidas causou problemas no uso de produtos químicos de protección da pataca.
Debido ás diferenzas significativas entre oomicetos e fungos na composición química, ultraestrutura e metabolismo, os funxicidas, especialmente os sistémicos empregados para protexer as plantas de moitas enfermidades fúngicas, son ineficaces contra os oomicetos.
Polo tanto, na protección química contra o tizón tardío, empregáronse múltiples pulverizacións (ata 12 veces por tempada ou máis) con preparacións de contacto dun amplo espectro de acción. Un paso revolucionario foi o uso de fenilamidas, que son tóxicas para os oomicetos e se espallan sistematicamente nas plantas. Non obstante, o seu uso xeneralizado levou rapidamente á acumulación de cepas resistentes en poboacións de fungos (Davidse et al., 1981), o que complicou significativamente a protección das plantas. P. infestans é practicamente o único parasito da zona temperada, o dano no que na agricultura ecolóxica non se pode neutralizar sen o uso de medios químicos de protección (Van Bruggen, 1995).
O anterior explica a enorme atención prestada por investigadores de diferentes países ao estudo das poboacións de P. infestans, a dinámica da súa abundancia e composición xenética, así como os mecanismos xenéticos de variabilidade.
Ciclo vital de R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans desenvolve un micelio intercelular con haustoria dentro das follas da pataca. Alimentándose dos tecidos da folla, provoca a formación de manchas escuras, que se volven negras e podrecen en tempo húmido. Cunha forte derrota, toda a folla morre. Despois dun período de alimentación, os micelios (esporanxióforos) que crecen cara a fóra a través dos estomas fórmanse. No tempo húmido, forman unha floración branca arredor das manchas na parte inferior das follas. Nos extremos dos esporangióforos fórmanse zoosporangios en forma de limón que se rompen e son transportados por chuvia (Fig. 1). Caendo en pingas de auga na superficie dunha folla de pataca, os esporanxios xerminan con 6-8 zoosporas, que, despois dun período de movemento, son redondeadas, cubertas cunha cuncha e xerminan cun tubo de xermolo. O brote penetra a través dos estomas no tecido foliar. En certas condicións, os esporanxios poden crecer nun tubo de crecemento directamente cara ao tecido foliar. En condicións favorables, o tempo desde a infección ata a formación de nova esporulación é de só 3-4 días.
Unha vez no chan e filtrados polo chan, os esporanxios son capaces de infectar os tubérculos. Os tubérculos gravemente afectados podrecen durante o almacenamento; no débil afectado, a infección pode persistir ata a próxima tempada. Ademais, o axente causante do tizón tardío pode persistir no inverno en forma de oosporas (esporas sexuais en repouso de paredes grosas) no chan sobre restos vexetais e sementes de tomate. As ósporas fórmanse en órganos vexetais vivos cando as cepas de diferentes tipos de apareamento atopan unha humidade excesiva. Na primavera, a esporulación asexual fórmase nos tubérculos infectados plantados e nos residuos vexetais con oosporas; as zoosporas entran no chan e causan infección das follas inferiores das plantas. Nalgúns casos, o micelio pode crecer a partir do tubérculo infectado ao longo da parte verde da planta e normalmente aparece na parte superior do talo.
Unha diferenza significativa entre os omicetos e a maioría dos fungos reside no predominio da diplofase no seu ciclo de vida con meiose gamética e xerminación de cigotos (oosporas) sen fisión nuclear redutora. Esta característica, máis o heterotallismo dipolar que substitúe á bisexualidade, parecería facer posible aplicar aos oomicetos os enfoques desenvolvidos para estudar poboacións de eucariotas superiores (análise de panmixia e subdivisión de poboacións, fluxos de xenes intra e interpoboación, etc.). Non obstante, tres factores non permiten transferir completamente estes enfoques no estudo das poboacións de P. infestans.
1. Xunto coas oosporas híbridas, fórmanse nas poboacións oosporas autofértiles e partenoxenéticas (Fife e Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), e a frecuencia da súa formación pode ser suficiente para influír sobre os resultados da proba.
2. O proceso sexual en P. infestans contribúe de xeito insignificante á dinámica do tamaño da poboación, porque o fungo reprodúcese principalmente por esporas vexetativas, formando máis do 90% dos resultados da análise do tipo de apareamento polo método tradicional nun medio nutritivo. ... a estación de crecemento é de varias xeracións de esporulación asexual (desenvolvemento de enfermidades policíclicas). As ósporas xogan un papel importante na preservación do organismo durante o período de ausencia de plantas verdes (no inverno) e na infección primaria das mudas. Despois, durante o verán, prodúcese a reprodución clonal e aumenta ou, pola contra, diminúe o número de clons individuais xurdidos como resultado da recombinación sexual, que se determina principalmente pola selección dos máis adaptados. Polo tanto, a proporción de clons individuais nunha poboación ao comezo e ao final dos epifitóticos pode ser completamente diferente.
3. O ciclo descrito é característico das poboacións nativas de P. infestans na súa terra natal, Centroamérica. Noutras zonas do mundo, o proceso sexual non se coñecía durante máis de 100 anos; o micelio vexetativo nos tubérculos de pataca infectados foi a etapa de invernada. O ciclo de vida era completamente agámico e a propagación tiña un foco na natureza: a infección por tubérculos plantados infectados pasaba ás follas, formando focos primarios da enfermidade, que poderían fundirse durante o desenvolvemento masivo da enfermidade.
Así, nalgunhas rexións pode haber unha alternancia de ciclos sexuais e asexuais, mentres que noutras, só ciclo asexual.
Orixe de P. INFESTANS
P. infestans apareceu en Europa a finais da primeira metade do século XIX. Dado que a pataca é orixinaria do nordeste de América do Sur, supúxose que o parasito foi traído de alí a Europa durante o auxe do salitre chileno. Non obstante, os estudos realizados na estación de pataca do Rockefeller Center no val do Toluca, México obrigaron a revisitar este punto de vista (Niederhauser, 1991, 1993).
1. No val do Toluca, as especies locais de pataca tuberosa (Solanum demissum, S. bulbocastanum, etc.) teñen diferentes conxuntos de xenes para a resistencia vertical combinados cun alto nivel de resistencia inespecífica, o que indica unha longa evolución co parasito. As especies suramericanas, incluídas as patacas cultivadas, carecen de xenes de resistencia.
2. No val do Toluca hai illados con tipos de apareamento A1 e A2, como resultado dos cales a poboación mestiza de P. infestans está moi estendida; mentres que na patria da pataca cultivada, Sudamérica, o parasito esténdese clonalmente.
3. No val do Toluca, hai epidemias graves anuais de tizón tardío. Polo tanto, entre os investigadores norteamericanos (Cornell University), establécese a opinión sobre Mesoamérica (Centroamérica) como berce da fitophthora da pataca (Goodwin et al., 1994).
Os investigadores sudamericanos non comparten esta opinión. Cren que a pataca cultivada e o seu parasito P. infestans teñen unha patria común: os Andes sudamericanos. Apoiaron o seu punto de vista en estudos moleculares sobre a análise de polimorfismos de ADN do xenoma mitocondrial (ADNmt) e dos xenes nucleares RAS e β-tubulina (Gomez-Alpizar et al., 2007). Mostraron que as cepas recollidas de diferentes partes do mundo descendían de tres liñas ancestrais diverxentes que (as tres) se atopan nos Andes sudamericanos. Os haplotipos andinos son descendentes de dúas liñas: os illados da liñaxe de ADNmt máis antiga atópanse nas Solanáceas salvaxes da sección Anarrhicomenum no Ecuador, mentres que os illados da segunda liña son comúns en patacas, tomates e solanáceas. En Toluca, incluso os haplotipos raros descenden dunha soa liñaxe, coa variabilidade xenética das cepas de Toluca (baixa frecuencia alélica dalgúns sitios variables) suxire un forte efecto fundador debido á recente deriva.
Ademais, atopouse unha nova especie P. andina nos Andes, morfolóxica e xeneticamente similar a P. infestans, que, segundo os autores, sinala aos Andes como un punto quente de especiación no xénero Phytophthora. Finalmente, en Europa e Estados Unidos, as poboacións de P. Infestans inclúen ambas liñaxes andinas, mentres que en Toluca só unha.
Esta publicación provocou a resposta dun grupo de investigadores de diferentes países, que fixeron moitos traballos experimentais para revisar o estudo anterior (Goss et al., 2014). Neste traballo, en primeiro lugar, empregáronse secuencias de ADN microsatélite máis informativas para estudar polimorfismos de ADN; en segundo lugar, para a análise de agrupacións, camiños de migración, tempo de diverxencia de poboacións, etc. empregáronse modelos máis avanzados (estatísticas F, aproximacións bayesianas, etc.) e, en terceiro lugar, utilizouse unha comparación non só coa especie andina P. andina, na que se estableceu unha natureza híbrida (P. infestans x Phytophthora sp.) , pero tamén coas especies endémicas mexicanas P. mirabilis, P. Ipomoeae e Phytophthora phaseoli - xeneticamente próximas a P. infestans pertencentes ao mesmo clado (Kroon et al., 2012). Como resultado destas análises, mostrouse sen ambigüidades que a parte raíz da árbore filoxenética de todas as especies do xénero Phytophthora tomadas no estudo, agás o híbrido P. andina, pertence a cepas mexicanas e o fluxo migratorio ten a dirección México - Andes e non viceversa, e o seu comezo coincide co europeo colonización do Novo Mundo (hai 300-600 anos). Así, a aparición da especie de P. infestans especializada na derrota das patacas produciuse no centro xenético secundario da formación de plantas solanáceas tuberosas, é dicir. en Centroamérica.
Xenoma de P. INFESTANS
En 2009, un equipo internacional de científicos secuenciou o xenoma completo de P infestans (Haas et al, 2009), cuxo tamaño era de 240 MB. Isto é varias veces máis que nas especies estreitamente relacionadas P. sojae (95 Mb), que causan a podremia das soias, e P. Ramorum (65 Mb), que afectan a especies de árbores tan valiosas como o carballo, a faia e algunhas outras. Os datos obtidos mostraron que o xenoma contén un gran número de copias de secuencias repetidas: o 74%. O xenoma contén 17797 xenes que codifican proteínas, a maior parte dos cales son xenes implicados en procesos celulares, incluída a replicación do ADN, a transcrición e a tradución de proteínas.
Unha comparación de xenomas do xénero Phytophthora revelou unha organización inusual do xenoma, que consiste en bloques de secuencias de xenes conservados, nos que a densidade xénica é relativamente alta e o contido de secuencias repetidas é relativamente baixa, e rexións individuais con secuencias xénicas non conservadas, cunha baixa densidade xénica e un alto contido de rexións repetitivas. Os bloques conservadores representan o 70% (12440) de todos os xenes que codifican as proteínas de P. infestans. Dentro de bloques conservadores, os xenes normalmente están moi espaciados cunha distancia interxénica media de 604 pb. En áreas entre bloques conservadores, a distancia interxénica é maior (3700 pb) debido a un aumento da densidade de elementos que se repiten. Os xenes secretores efectores que evolucionan rapidamente localízanse en rexións pobres en xenes.
A análise de secuencia do xenoma de P. Infestans mostrou que aproximadamente un terzo do xenoma pertence a elementos transpoñibles. O xenoma de P. infestans contén significativamente máis familias diferentes de transposóns que outros xenomas coñecidos. A maioría dos transposóns de P. infestans pertencen á familia dos xitanos.
No xenoma de P. infestans identificáronse un gran número de familias de xenes específicas implicadas na patoxénese. Unha parte significativa delas codifican proteínas efectoras que cambian a fisioloxía da planta hóspede e contribúen á súa infección. Divídense en dúas grandes categorías: os efectores apoplásticos, que actúan nos espazos intercelulares (apoplastos) e os efectores citoplasmáticos, que entran nas células a través da haustoria. Os efectores apoplásticos inclúen encimas hidrolíticos segregados como proteasas, lipasas e glicosilases que destrúen as células vexetais; inhibidores dos encimas de defensa das plantas hóspede e toxinas necrotizantes como proteínas similares a Nep1 (NPLs) e pequenas proteínas ricas en cisteína (SCRs) similares a Pcf.
Os xenes efectores de P. infestans son numerosos e normalmente máis grandes que os xenes non patóxenos. Os máis coñecidos son os efectores citoplasmáticos RXLR e Crinkler (CNR). Os efectores citoplasmáticos típicos dos oomicetos son as proteínas RXLR. Todos os xenes efectores RXLR descubertos ata o momento conteñen o grupo amino-terminal Arg-XLeu-Arg, onde X é un aminoácido. Como resultado do estudo, suxeriuse que hai 563 xenes RXLR no xenoma de P. infestans, o que supón un 60% máis que en P. sojae e P. ramorum. Aproximadamente a metade dos xenes RXLR no xenoma de P. infestans son específicos de especies. Os efectores RXLR teñen unha gran variedade de secuencias. Entre elas, identificáronse unha familia numerosa e 150 pequenas. A diferenza do proteoma principal, os xenes efectores RXLR adoitan localizarse en rexións pobres en xenes e ricas en repeticións do xenoma. Os elementos móbiles que determinan o dinamismo destas rexións facilitan a recombinación nestes xenes.
Os efectores citoplasmáticos de CRN identificáronse orixinalmente en transcritos de P. infestans que codificaban péptidos de necrose nos tecidos vexetais. Dende o seu descubrimento, pouco se soubo da familia destes efectores. A análise do xenoma de P. Infestans revelou unha enorme familia de 196 xenes CRN, que é moito maior que a de P. sojae (100 CRN) e P. ramorum (19 CRN). Do mesmo xeito que os RXLR, os CRN son proteínas modulares e consisten nun dominio LFLAK N-terminal moi conservado (50 aminoácidos) e un dominio DWL adxacente que contén diferentes xenes. A maioría das CRN (60%) posúen un péptido sinal.
Estudouse a posibilidade de que varias CRN interrompan os procesos celulares da planta hóspede. Na análise da necrose vexetal, a eliminación de proteínas CRN2 permitiu identificar a rexión C-terminal composta por 234 aminoácidos (posicións 173-407, dominio DXG) e causar a morte celular. A análise dos xenes CRN de P. infestans revelou catro rexións C-terminais diferentes, que tamén causan a morte celular dentro da planta. Estes inclúen os dominios DC recentemente identificados (P. Infestans ten 18 xenes e 49 pseudoxenes), así como os dominios D2 (14 e 43) e DBF (2 e 1) similares ás proteínas quinases. As proteínas dos dominios CRN expresadas nunha planta consérvanse (en ausencia de péptidos sinal) nunha célula vexetal e estimulan a morte celular por un mecanismo intracelular. Outras 255 secuencias que conteñen dominios CRN probablemente non funcionen como xenes.
O aumento no número e tamaño das familias de xenes efectores RXLR e CRN debíase presumiblemente á recombinación homóloga non alélica e á duplicación de xenes. A pesar de que o xenoma contén un gran número de elementos móbiles activos, aínda non hai evidencias directas da transferencia de xenes efectores.
Métodos empregados no estudo da estrutura da poboación
O estudo da estrutura xenética das poboacións baséase actualmente na análise de cultivos puros das súas cepas constituíntes. A análise de poboacións sen illar cultivos puros tamén se realiza para fins específicos, como, por exemplo, estudar a agresividade dunha poboación ou a presenza de cepas resistentes a funxicidas nela (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Este tipo de investigación implica o uso de métodos especiais, cuxa descrición está fóra do alcance desta revisión. Para a análise comparativa de cepas utilízanse unha serie de métodos, baseados tanto na análise da estrutura do ADN como no estudo de manifestacións fenotípicas. A análise comparativa das poboacións ten que tratar cun gran número de illados, o que impón certos requisitos aos métodos empregados. Idealmente deberían cumprir os seguintes requisitos (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- ser barato, fácil de implementar, non require custos de tempo significativos, basearse en tecnoloxías xeralmente dispoñibles (por exemplo, PCR);
- debe xerar un número suficientemente grande de características de marcador codominante independentes;
- teñen alta reprodutibilidade;
- use a cantidade mínima de tecido para examinar;
- ser específico do substrato (a contaminación presente no cultivo non debe afectar os resultados);
- non requiren o uso de procedementos perigosos e produtos químicos altamente tóxicos.
Desafortunadamente, non hai métodos correspondentes a todos os parámetros anteriores. Para un estudo comparativo de cepas no noso tempo, utilízanse métodos baseados na análise de trazos fenotípicos: virulencia ás variedades de pataca e tomate (razas de patacas e tomates), tipo de apareamento, espectros de isoenzimas da peptidasa e glicosa-6-fosfato isomerase e na análise da estrutura do ADN: polimorfismo de lonxitude fragmento de restrición (RFLP), que normalmente se complementa cunha sonda de hibridación RG 57, análise de repeticións de microsatélites (SSR e InterSSR), amplificación con cebadores aleatorios (RAPD), amplificación de fragmentos de restrición (AFLP), amplificación con cebadores homólogos ás secuencias de elementos móbiles (por exemplo, Inter SINE PCR), determinación de haplotipos de ADN mitocondrial.
Breves descricións dos métodos de estudo comparativo de cepas empregadas no traballo con P. Infestans
Trazos de marcador fenotípico
Carreiras de "patacas"
As carreiras de "patacas" son un marcador de investigación e uso común. As razas "patacas simples" teñen un xene para a virulencia da pataca, as "complexas", polo menos dúas. Black et al. (1953), resumindo todos os datos dispoñibles, descubriron que a raza phytophthora é capaz de infectar ás plantas co xene / xenes de resistencia correspondentes ao xene / xenes de virulencia de P. infestans e atoparon as razas 1, 2, 3 e 4 que infectan as plantas. cos xenes R1, R2, R3 e R4, respectivamente, i.e. a interacción entre o parasito e o hóspede prodúcese segundo o principio do xene para o xene. Ademais, Black, coa participación de Gallegly e Malcolmson, descubriu os xenes de resistencia R5, R6, R7, R8, R9, R10 e R11, así como as razas correspondentes (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Hai un amplo conxunto de datos sobre a composición racial do patóxeno de diferentes rexións. Sen analizar estes datos polo miúdo, indicaremos só unha tendencia xeral: onde se empregaron variedades con novos xenes de resistencia ou as súas combinacións, nun primeiro momento houbo algún debilitamento do tizón tardío, pero despois apareceron e seleccionáronse razas cos correspondentes xenes de virulencia e retomáronse os brotes de tizón tardío. Virulencia específica contra os primeiros 4 xenes de resistencia (R1-R4) raramente se observou nas coleccións recollidas antes da introdución no cultivo de variedades con estes xenes, pero o número de cepas virulentas aumentou bruscamente cando o patóxeno foi parasitado nas variedades que portaban estes xenes. Os xenes 5-11, por outra banda, eran bastante comúns nas coleccións (Shaw, 1991).
Un estudo da proporción de diferentes razas durante a estación de crecemento, realizado a finais dos anos oitenta, mostrou que ao comezo do desenvolvemento da enfermidade predominan na poboación clons con baixa agresividade e 1980-1 xenes de virulencia.
Ademais, co desenvolvemento do tizón tardío, a concentración dos clons orixinais diminúe e aumenta o número de razas "complexas" con alta agresividade. A aparición destes últimos ao final da tempada alcanza o 100%. Cando se almacenan tubérculos, hai unha diminución da agresividade e perda de xenes de virulencia individuais. A dinámica da substitución de clons pode producirse en diferentes variedades de diferentes xeitos (Rybakova e Dyakov, 1990). Non obstante, os nosos estudos realizados no período 2000-2010 demostraron que as razas complexas atópanse desde o comezo dos epifitóticos entre cepas illadas tanto de patacas como de tomates. Isto débese probablemente a un cambio nas poboacións de P. Infestans en Rusia.
En 1988-1995, a aparición de "superrazas" con todos ou case todos os xenes de virulencia en diferentes rexións alcanzou o 70-100%. Tal situación observouse, por exemplo, en Bielorrusia, nas rexións de Leningrado, Moscova, en Osetia do Norte e en Alemaña (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
Carreiras de "tomates"
Nos cultivares de tomate só se atoparon 2 xenes de resistencia ao tizón tardío: Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) e Ph2 (Al-Kherb, 1988). Como no caso das razas da pataca, a interacción entre os tomates e P. infestans prodúcese de xeito xenético. A raza T0 infecta variedades que non teñen xenes de resistencia (a maioría das variedades usadas industrialmente), a raza T1 infecta variedades co xene Ph1 (Ottawa) e a raza T2 infecta variedades co xene Ph2.
En Rusia, case exclusivamente T0 atopouse nas patacas; A tomate predominou nos tomates a principios de tempada, pero máis tarde foi substituída pola carreira T0 (Dyakov et al., 1, 1975). Despois do 1994, o T2000 en patacas en moitas poboacións comezou a producirse ao comezo do período epifitótico. Nos Estados Unidos, as cepas de pataca non eran patóxenas para o tomate, así como as razas T1, T0 e T1, mentres que T2 e T1 prevalecían nos tomates (Vartanian e Endo, 2; Goodwin et al., 1985).
Tipo de apareamento
Para realizar o estudo, cómpre cepas probadoras (de referencia) con tipos de apareamento coñecidos - A1 e A2. O illado de proba inocúlase con eles en parellas en placas de Petri con medio de agar de avea. Despois da incubación durante 10 días, as placas son examinadas para a presenza ou ausencia de oosporas no medio na zona de contacto das cepas. Hai 4 opcións: a cepa pertence ao tipo de apareamento A1, se forma oosporas co probador A2, a A2, se forma oosporas co probador A1, a A1A2, se forma oosporas con ambos probadores ou é estéril (00), se non forma oosporas sen probador (os dous últimos grupos son raros).
Para determinar máis rápido os tipos de apareamento, intentáronse identificar rexións do xenoma asociadas ao tipo de apareamento, co obxectivo de que se usasen máis para determinar o tipo de apareamento por PCR. Un dos primeiros experimentos exitosos para identificar tal sitio foi realizado por investigadores estadounidenses (Judelson et al., 1995). Usando o método RAPD, puideron identificar a rexión W16 asociada ao tipo de apareamento na descendencia dos dous illados cruzados e deseñar un par de cebadores de 24 pb para a súa amplificación (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') e W16-2 (5') -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Despois da restrición do produto PCR co encima de restrición HaeIII, foi posible separar illados cos tipos de emparejamento A1 e A2.
Outro intento de obter marcadores de PCR para determinar os tipos de apareamento foi realizado por investigadores coreanos (Kim, Lee, 2002). Identificaron produtos específicos usando o método AFLP. Como resultado, desenvolvéronse un par de cebadores PHYB-1 (adiante) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') e PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), o que permitiu a amplificación selectiva da rexión do xenoma asociada ao tipo de apareamento A2. Posteriormente, continuaron este traballo e deseñaron os cebadores 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, adiante) e 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), permitindo a amplificación selectiva da rexión Mat-A1, característica das cepas con tipo de apareamento A1. O uso de diagnósticos por PCR de tipos de apareamento mostrou bos resultados no estudo das poboacións de P. infestans na República Checa (Mazakova et al., 2006), Túnez (Jmour, Hamada, 2006) e outras rexións. No noso laboratorio (Mytsa, Elansky, inédito) analizáronse 34 cepas de P. infestans illadas de órganos de pataca e tomate enfermos en diferentes rexións de Rusia (Kostroma, Ryazan, Astrakhan, oblastos de Moscova). Os resultados da análise de PCR usando cebadores específicos máis do 90% coincidiron cos resultados da análise do tipo de apareamento polo método tradicional nun medio nutritivo.
Táboa 1. Variabilidade da resistencia dentro do clon Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Localización da recollida de mostras | Número de illados analizados | Número de cepas sensibles (S), débilmente resistentes (SR) e resistentes (R), unidades (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnoyarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Cidade de Ekaterimburgo | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sakhalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Rexión de Omsk | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
A resistencia ao metalaxilo como marcador da poboación
A principios dos anos oitenta, observáronse fortes brotes de tizón tardío causados por cepas de P. infestans resistentes ao metalaxil en varias rexións. As explotacións de patacas en moitos países sufriron importantes perdas (Dowley e O'Sullivan, 1980; Davidse et al., 1981; Derevyagina, 1983). Desde entón, en moitos países do mundo, realizouse un control constante da aparición de cepas resistentes á fenilamida nas poboacións de P. infestans. Ademais dunha avaliación práctica das perspectivas de uso de medicamentos que conteñen fenilamida, a creación dun sistema de medidas de protección e a predición de epifitotías, a resistencia a estes medicamentos converteuse nunha das características marcadoras amplamente utilizadas para a análise comparativa das poboacións deste patóxeno. Non obstante, o uso da resistencia ao metalaxilo en estudos comparativos de poboación debería realizarse tendo en conta que: 1991 - a base xenética da resistencia aínda non foi determinada con precisión, 1 - a resistencia ao metalaxilo é un trazo selectivamente dependente que pode cambiar dependendo do uso de fenilamidas, 2 - diferente o grao de sensibilidade ás cepas de metalaxilo dentro dunha liña clonal (táboa. 3).
Espectros de isozimas
Os marcadores de isozima adoitan ser independentes das condicións externas, mostran herdanza mendeliana e son codominantes, o que permite distinguir entre os homo- e os heterocigotos. O uso de proteínas como marcadores xénicos permite identificar tanto grandes reorganizacións do material xenético, incluíndo mutacións cromosómicas e xenómicas, como substitucións de aminoácidos individuais.
Os estudos electroforéticos de proteínas demostraron que a maioría dos encimas existen nos organismos en forma de varias fraccións que difiren na mobilidade electroforética. Estas fraccións son o resultado de codificar múltiples formas de encimas por loci diferentes (isozimas ou isozimas) ou por diferentes alelos do mesmo locus (alozimas ou aloenzimas). É dicir, as isozimas son diferentes formas dun encima. Diferentes formas teñen a mesma actividade catalítica, pero difiren lixeiramente nas substitucións de aminoácidos individuais no péptido e no seu cargo. Estas diferenzas revélanse durante a electroforese.
No estudo das cepas de P. infestans, utilízanse os espectros de isoenzimas de dúas proteínas, a peptidasa e a glicosa-6-fosfato isomerase (este encima é monomorfo nas poboacións rusas, polo tanto, os métodos do seu estudo non se presentan neste traballo). Para separalos en isozimas nun campo eléctrico, as preparacións de proteínas illadas dos organismos estudados aplícanse a unha placa de xel colocada nun campo eléctrico. A velocidade de difusión de proteínas individuais no xel depende da carga e do peso molecular; polo tanto, nun campo eléctrico, a mestura de proteínas sepárase en fraccións separadas, que se poden visualizar usando colorantes especiais.
O estudo dos isoenzimas da peptidasa lévase a cabo en xeles de acetato de celulosa, amidón ou poliacrilamida. O máis conveniente é o método baseado no uso de xeles de acetato de celulosa fabricados por Helena Laboratories Inc. Non require grandes cantidades de materiais de proba, permite obter bandas contrastantes no xel despois da electroforese para ambos loci enzimáticos, a súa implementación non require custos de tempo e material elevados (Fig. 2).
Un pequeno anaco de micelio transfírese a un microtubo de 1,5 ml, engádenselle 1-2 gotas de auga destilada. Despois diso, a mostra homoxénese (por exemplo, cun taladro eléctrico cun accesorio de plástico adecuado para un microtubo) e sedimentase durante 25 segundos nunha centrífuga a 13000 rpm. 8 μl de cada microtubo. o sobrenadante transfírese á placa aplicadora.
O xel de acetato de celulosa retírase do recipiente tampón, borra entre dúas follas de papel filtrante e colócase coa capa de traballo sobre a base de plástico do aplicador. A aplicación da placa transfírese polo aplicador ao xel de 2 a 4 veces. O xel transfírese a unha cámara de electroforese,
Táboa 2. A composición da solución utilizada para tinguir o xel de acetato de celulosa na análise dos isoenzimas da peptidasa, colócase unha gota de pintura (azul de bromofenol) no bordo do xel.
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroxidase, 1000 U / ml 5 gotas
o-dianisidina, 4 mg / ml 8 gotas
MgCl2, 20 mg / ml 2 gotas
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 gotas
L-aminoácido oxidase, 20 u / ml 2 gotas
A electroforese lévase a cabo durante 20 minutos. a 200 V. Despois da electroforese, o xel transfírese a unha mesa de pintura e píntase cunha solución especial de pintura (táboa 2). 10 ml de agar DIFCO ao 1,6% fúndese preliminarmente nun forno de microondas, arrefriouse a 60 ° C, despois dos cales 2 ml de agar mestúranse cunha mestura de pintura e vértense sobre o xel. As raias aparecen dentro de 15-20 minutos. O reactivo L-aminoácido oxidase engádese xusto antes de mesturar a solución con agar fundido.
Nas poboacións rusas, o locus Pep 1 está representado polos xenotipos 100/100 e 92/100. O homocigoto 92/92 é extremadamente raro (aproximadamente o 0,1%). Locus Rehr 2 está representado por tres xenotipos 100/100, 100/112 e 112/112, e as 3 variantes son bastante comúns (Elanky e Smirnov, 2003, Fig. 2).
Investigación do xenoma
Polimorfismo de lonxitude de fragmento de restrición con posterior hibridación (RFLP-RG 57)
O ADN total trátase con encima de restrición Eco R1, os fragmentos de ADN sepáranse por electroforese en xel de agarosa. O ADN nuclear é moi grande e ten moitas secuencias repetitivas, o que dificulta a análise directa dos numerosos fragmentos obtidos pola acción dos encimas de restrición. Polo tanto, os fragmentos de ADN separados no xel transfírense a unha membrana especial e úsanse para a hibridación coa sonda RG 57, que inclúe nucleótidos marcados con etiquetas radioactivas ou fluorescentes. Esta sonda hibridase con secuencias repetitivas do xenoma (Goodwin et al., 1992; Forbes et al., 1998). Despois da visualización dos resultados da hibridación sobre un material lixeiro ou radioactivo, obtense un perfil de hibridación multi-locus (pegada dixital), representado por 25-29 fragmentos (Forbes et al., 1998). A descendencia asexual (clonal) terá os mesmos perfís. Pola disposición das bandas no electroforetograma, pódese xulgar as similitudes e diferenzas dos organismos comparados.
Haplotipos de ADN mitocondrial
Na maioría das células eucariotas, o ADNmt preséntase en forma de molécula de ADN circular de dobre cadea, que, a diferenza dos cromosomas nucleares das células eucariotas, replícase de forma semiconservativa e non está asociada a moléculas de proteína.
O xenoma mitocondrial de P. infestans foi secuenciado e dedicáronse varios traballos á análise das lonxitudes de fragmentos de restrición (Carter et al, 1990; Goodwin, 1991; Gavino, Fry, 2002). Despois de que Griffith e Shaw (1998) desenvolveran un método sinxelo e rápido para determinar os haplotipos de ADNmt, este marcador converteuse nun dos máis populares nos estudos de P. Infestans. A esencia do método consiste na amplificación secuencial de dous fragmentos de ADN mitocondrial (do xenoma común) cos cebadores F2-R2 e F4-R4 (Táboa 3) e a súa posterior restrición cos encimas de restrición MspI (primeiro fragmento) e EcoR1 (segundo fragmento). O método permítelle identificar 1 haplotipos: Ia, IIa, Ib, IIb. O tipo II diferénciase do tipo I pola presenza dun inserto de 2 pb de tamaño e por unha localización diferente dos sitios de restrición nas rexións P4 e P1881 (Fig. 2).
Desde 1996, entre as cepas recollidas no territorio de Rusia, só se observaron os haplotipos Ia e IIa (Elansky et al., 2001, 2015). Pódense identificar despois da separación dos produtos de restrición co cebador F2-R2 nun campo eléctrico (Fig. 4, 5). Os tipos de ADNmt úsanse na análise comparativa de cepas e poboacións. Nun número de traballos empregáronse tipos de ADN mitocondrial para illar liñas clonais e pasaportar illados de P. infestans (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Usando o método PCR-RFLP, concluíuse que o ADNmt é heteroxéneo na mesma cepa de P. infestans (Elansky e Milyutina, 2007). Condicións de amplificación: 1x (500 seg. 94 ° C), 40x (30 seg. 90 ° C, 30 seg. 52 ° C, 90 seg. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Mestura de reacción: (20 μl): 0,2 U Taq ADN polimerase, 1 x 2,5 mM de tampón MgCl2-Taq, 0,2 mM cada dNTP, 30 pM cebador e 5 ng do ADN analizado, auga desionizada - ata 20 μl.
A restrición do produto PCR lévase a cabo durante 4-6 horas a unha temperatura de 37 ° C. Mestura de restrición (20 μl): 10x MspI (2 μl), tampón de restricción 10x (2 μl), auga desionizada (6 μl), produto de PCR (10 μl).
Táboa 3. Imprimacións empregadas para a amplificación de rexións polimórficas de ADNmt
Locus | Primer | Lonxitude e colocación da imprimación | Lonxitude do produto PCR | Restrictase |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Amplificación de cebador aleatorio (RAPD)
Cando se realiza RAPD, úsase un cebador (ás veces varios cebadores simultaneamente) cunha secuencia de nucleótidos arbitraria, normalmente de 10 nucleótidos de lonxitude, cun alto contido (desde o 50%) de nucleótidos GC e unha baixa temperatura de recocido (aproximadamente 35 ° C). Estes cebadores "aterran" en numerosos sitios complementarios do xenoma. Despois da amplificación, obtense un gran número de amplicóns. O seu número depende dos cebadores empregados e das condicións de reacción (concentración de MgCl2 e temperatura de recocido).
A visualización de amplicóns lévase a cabo mediante destilación en xel de poliacrilamida ou agarosa. Ao realizar a análise RAPD, é necesario controlar atentamente a pureza do material analizado, xa que a contaminación con outros obxectos vivos pode causar un aumento significativo no número de artefactos, que son bastante numerosos na análise de material puro (Perez et al, 1998). O uso deste método no estudo do xenoma de P. infestans reflíctese en moitos traballos (Judelson, Roberts, 1999; Ghimire et al., 2002; Carlisle et al., 2001). A selección das condicións de reacción e cebadores (estudáronse 51 cebadores de 10 nucleótidos) no artigo de Abu-El Samen et al., (2003).
Análise de repetición de microsatélites (SSR)
As repeticións de microsatélites (repeticións de secuencias simples, SSR) son repeticións conxuntas de secuencias curtas de 1-3 (ás veces ata 6) nucleótidos presentes nos xenomas nucleares de todos os eucariotas. O número de repeticións sucesivas pode variar de 10 a 100. Os loci microsatélites prodúcense cunha frecuencia bastante alta e distribúense máis ou menos uniformemente polo xenoma (Lagercrantz et al., 1993). O polimorfismo das secuencias de microsatélites está asociado a diferenzas no número de repeticións do motivo básico. Os marcadores microsatélites son codominantes, o que permite usalos para analizar a estrutura dunha poboación, determinar parentesco, camiños de migración de xenotipos, etc. Entre outras vantaxes destes marcadores, cómpre destacar o seu alto polimorfismo, boa reprodutibilidade, neutralidade e capacidade para realizar análises e avaliacións automáticas.A análise do polimorfismo das repeticións de microsatélites lévase a cabo mediante amplificación por PCR usando cebadores complementarios a secuencias únicas que flanquean loci de microsatélites. Inicialmente, a análise realizouse coa separación dos produtos de reacción nun xel de poliacrilamida. Máis tarde, os empregados de Applied Biosystems propuxeron empregar cebadores marcados fluorescentemente coa detección de produtos de reacción mediante un detector láser automático (Diehl et al., 1990), e despois secuenciadores automáticos de ADN estándar (Ziegle et al., 1992). A etiquetaxe de cebadores con varios colorantes fluorescentes permite analizar varios marcadores á vez nun carril e, en consecuencia, aumentar significativamente a produtividade do método e aumentar a precisión da análise.
As primeiras publicacións dedicadas ao uso da análise SSR para o estudo de P. infestans apareceron a principios dos anos 2000. (Knapova, Gisi, 2002). Non todos os marcadores propostos polos autores mostraron un grado suficiente de polimorfismo, con todo, dous deles (4B e G11) incluíronse no conxunto de 12 marcadores SSR propostos por Lees et al. (2006) e posteriormente adoptados na rede de investigación Eucablight (www.eucablight .org) como estándar para P. infestans. Poucos anos despois, publicouse un estudo sobre a creación dun sistema para a análise multiplex do ADN de P. infestans baseado en oito marcadores SSR (Li et al., 2010). Finalmente, despois de avaliar todos os marcadores propostos anteriormente e seleccionar o máis informativo deles, así como optimizar cebadores, etiquetas fluorescentes e condicións de amplificación, o mesmo grupo de autores presentou un sistema para a análise multiplex dun só paso, incluíndo 12 marcadores (táboa 4; Li et al. , 2013a). Os cebadores empregados neste sistema seleccionáronse e etiquetáronse cun dos catro marcadores fluorescentes (FAM, VIC, NED, PET) de xeito que os rangos dos tamaños de alelos dos cebadores coas mesmas etiquetas non se solapaban.
Os autores realizaron a análise nun amplificador PTC200 (MJ Research, EUA) empregando kits de PCR multiplex QIAGEN ou kits de PCR QIAGEN Typeit Microsatellite. O volume da mestura de reacción foi de 12.5 μL. As condicións de amplificación foron as seguintes: para QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min); para QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 seg), 58 ° C (90 seg), 72 ° C (20 seg), 60 ° C (30 min)
A separación e visualización de produtos de PCR realizouse mediante un analizador automático de ADN capilar ABI3730 (Applied Biosystems).
Táboa 4. Características de 12 marcadores SSR estándar empregados para o xenotipado de P. Infestans (Li et al., 2013a)
nome | Número de alelos | Rango de tamaños alelos (bp) | Imprimacións |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
pi02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
pi04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
pi70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
pi63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGGCGAGGTTTGTAGATT |
Un exemplo de visualización dos resultados da análise móstrase na Fig. 6. Os resultados analizáronse mediante o software GeneMapper 3.7 comparando os datos obtidos cos datos de illados coñecidos. Para facilitar a interpretación dos resultados da análise, é necesario incluír 1-2 illados de referencia cun xenotipo coñecido en cada estudo.
O método de investigación proposto probouse nun número significativo de mostras de campo, logo dos cales os autores levaron a cabo a normalización de protocolos entre laboratorios de dúas organizacións, o James Hutton Institute (Reino Unido) e a Universidade e investigación de Wageningen (Países Baixos), que, xunto coa posibilidade de usar tarxetas FTA estándar para simplificar a recollida e envío de mostras de ADN de P. infestans permitiu falar da posibilidade de uso comercial deste desenvolvemento. Ademais, un método rápido e preciso de xenotipado de illados de P. infestans mediante análise SSR multiplex permitiu realizar estudos estandarizados de poboacións deste patóxeno a escala global e a creación dunha base de datos mundial sobre o tizón tardío no marco do proxecto Eucablight (www.eucablight.org), incluíndo , incluídos os resultados da análise de microsatélites, permitiron rastrexar a aparición e propagación de novos xenotipos polo mundo.
Polimorfismo de lonxitude de fragmento de restrición amplificado (AFLP). AFLP (polimorfismo de lonxitude de fragmento amplificado) é unha tecnoloxía para xerar marcadores moleculares aleatorios usando cebadores específicos. En AFLP, o ADN é tratado cunha combinación de dous encimas de restrición. Os adaptadores específicos están ligados aos extremos pegajosos dos fragmentos de restrición.
Estes fragmentos son entón amplificados empregando cebadores complementarios á secuencia do adaptador e ao sitio de restrición, e levando ademais unha ou máis bases aleatorias nos seus extremos 3 '. O conxunto de fragmentos obtidos depende de encimas de restrición e nucleótidos seleccionados ao azar nos extremos 3 'dos cebadores (Vos et al., 1995). AFLP - o xenotipado úsase para estudar rapidamente a variación xenética de varios organismos.
Unha descrición detallada do método ofrécese nos traballos de Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. Os investigadores chineses realizaron moitos traballos comparando a resolución dos métodos AFLP e SSR. Estudáronse as características fenotípicas e xenotípicas de 48 illados de P. infestans recollidos en cinco rexións do norte de China. En base aos espectros AFLP, identificáronse oito xenotipos de ADN diferentes, en contraste cos xenotipos SSR, para os que non se revelou diversidade (Guo et al., 2008).
Amplificación con cebadores homólogos ás secuencias de elementos móbiles
Os marcadores derivados de secuencias de retrotransposóns son moi convenientes para o mapeo xenético, o estudo da diversidade xenética e os procesos evolutivos (Schulman, 2006). Se se fan cebadores para complementar as secuencias estables de certos elementos móbiles, é posible amplificar as rexións do xenoma situadas entre eles. En estudos sobre o axente causante do tizón tardío, utilizouse con éxito o método de amplificación de rexións do xenoma empregando un cebador complementario á secuencia do núcleo da retroazona SINE (Elementos nucleares curtos) (Lavrova e Elansky, 2003). Usando este método, reveláronse diferenzas incluso na descendencia asexual dun illado. Neste sentido, concluíuse que o método inter-SINE-PCR é moi específico e que a taxa de movemento dos elementos SINE no xenoma de Phytophthora é elevada.
No xenoma de P. infestans identificáronse 12 familias de retrotransposóns curtos (SINE); investigouse a distribución das especies de retrotransposóns curtos, identificáronse elementos (SINE) que se atopan no xenoma de só P. infestans (Lavrova, 2004).
Características da aplicación de métodos de estudo comparativo de cepas en estudos poboacionais
Ao planificar un estudo, é necesario comprender claramente os obxectivos que persegue e empregar os métodos adecuados. Así, algúns métodos permiten xerar un gran número de signos de marcador independentes, pero ao mesmo tempo teñen unha baixa reprodutibilidade e dependen fortemente dos reactivos empregados, das condicións de reacción e da contaminación do material en estudo. Polo tanto, en cada estudo dun grupo de cepas, é necesario empregar varios illados estándar (de referencia), pero incluso neste caso, os resultados de varios experimentos son moi difíciles de combinar.
Este grupo de métodos inclúe RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Despois da amplificación, obtense un gran número de fragmentos de ADN de diferentes tamaños. É aconsellable empregar estas técnicas cando é necesario establecer diferenzas entre cepas estreitamente relacionadas (descendencia parental, mutantes de tipo salvaxe, etc.), ou nos casos en que se precise unha análise detallada dunha pequena mostra. Así, o método AFLP úsase amplamente na cartografía xenética de P. infestans (van der Lee et al., 1997) e nos estudos de intrapoboación (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Tales métodos non son prácticos de usar cando se crean bases de datos de cepas, xa que é practicamente imposible unificar a contabilidade dos resultados cando se realizan análises en diferentes laboratorios.
A pesar da aparente sinxeleza e velocidade de execución (illamento do ADN sen unha boa purificación, amplificación, visualización dos resultados), este grupo de métodos require o uso dun método especial para documentar os resultados: destilación en xel de poliacrilamida con cebadores marcados (radioactivos ou luminiscentes) e posterior exposición á luz ou material radioactivo. A imaxe convencional de xel de agarosa con bromuro de etidio xeralmente non é adecuada para estes métodos porque pode fusionarse un gran número de fragmentos de ADN de diferentes tamaños.
Pola contra, outros métodos permiten xerar un pequeno número de funcións coa súa reprodutibilidade moi alta. Este grupo inclúe o estudo de haplotipos de ADN mitocondrial (só hai dous haplotipos Ia e IIa en Rusia), tipo de apareamento (a maioría dos illados subdivídense en 2 tipos: A1 e A2, raramente se atopa SF autofértil) e espectros de isozima peptidasa (dous loci Pep1 e Pep2 , composto por dúas isozimas cada unha) e glicosa-6-fosfato isomerase (en Rusia non hai variabilidade neste trazo, aínda que se nota polimorfismo significativo noutros países do mundo). É recomendable empregar estas funcións ao analizar coleccións, compilar bases de datos rexionais e globais. No caso da análise de isozimas e haplotipos de ADN mitocondrial, é posible prescindir de cepas estándar, mentres que na análise dos tipos de apareamento son necesarios dous illados de proba con tipos de apareamento coñecidos.
As condicións de reacción e os reactivos só poden afectar o contraste do produto no electroforetograma; é improbable a manifestación de artefactos neste tipo de estudos.
Na actualidade, a maioría das poboacións da parte europea de Rusia están representadas por cepas de ambos tipos de apareamento (táboa 6), entre elas hai illados con tipos Ia e IIa de ADN mitocondrial (outros tipos de ADNmt atopados no mundo non se atoparon en Rusia despois de 1993). Os espectros das isozimas da peptidasa están representados por dous xenotipos no locus Pep1 (100/100, 92/92 e heterozigoto 92/100, e o xenotipo 92/92 é extremadamente raro (<0,3%)) e por dous xenotipos no locus Pep 2 (100/100 , 112/112 e heterozigoto 100/112, co xenotipo 112/112 ocorre con menos frecuencia que 100/100, pero tamén con bastante frecuencia).
Non houbo variabilidade no espectro de isoenzimas da glicosa-6-fosfato isomerase despois de 1993 (a desaparición da liña clonal US-1); todos os illados estudados tiñan o xenotipo 100/100 (Elansky e Smirnov, 2002).
O terceiro grupo de métodos permite obter un grupo suficiente de características de marcador independentes con alta reprodutibilidade. Hoxe, este grupo inclúe a sonda RFLP-RG57, que produce entre 25 e 29 fragmentos de ADN de diferentes tamaños. RFLP-RG57 pódese usar tanto cando se analizan mostras como se compilan bases de datos. Non obstante, este método é moito máis caro que os anteriores, leva moito tempo e require unha cantidade suficientemente grande de ADN altamente purificado. Polo tanto, o investigador vese obrigado a limitar o volume do material probado.
O desenvolvemento de RFLP-RG57 a principios dos anos 90 do século pasado intensificou significativamente os estudos poboacionais do axente causante do tizón tardío. Converteuse na base do método baseado na selección e análise de "Liñas clonais" (ver máis abaixo). Xunto con RFLP-RG57, utilízase o tipo de apareamento, a pegada dixital do ADN (método RFLP-RG57), os espectros de isoenzimas da peptidasa e glicosa-6-fosfato isomerase e o tipo de ADN mitocondrial para identificar as liñas clonais. Grazas a el, amosouse al., 1994), a substitución de poboacións antigas por outras novas (Drenth et al, 1993, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a), revelou liñas clonais prevalecentes en moitos países do mundo. Os estudos de cepas rusas que empregaron este método mostraron un alto polimorfismo xenotípico das cepas da parte europea e un monomorfismo das poboacións das partes asiática e do Extremo Oriente de Rusia (Elansky et al, 2001). E agora este método segue sendo o principal nos estudos de poboación de P. infestans. Non obstante, a súa ampla distribución vese dificultada polo seu custo e intensidade laboral moi elevados na execución.
Outra técnica prometedora que raramente se emprega nos estudos de P. infestans é a análise de repetición de microsatélites (SSR). Actualmente, este método úsase amplamente para illar liñas clonais. Para a análise de cepas, usáronse amplamente (e continúan a usarse) trazos de marcador fenotípicos como a presenza de xenes de virulencia nas variedades de pataca (Avdey, 1995; Ivanyuk et al., 2002; Ulanova et al., 2003) e o tomate. Ata agora, os xenes de virulencia ás variedades de pataca perderon o seu valor como trazos marcadores para estudos de poboación debido á aparición do número máximo (ou próximo a el) de xenes de virulencia na gran maioría dos illados. Ao mesmo tempo, o xene da virulencia T1 para cultivares de tomate que levan o xene Ph1 correspondente aínda se usa con éxito como trazo marcador (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
En moitos estudos, a resistencia a funxicidas úsase como marcador. Este trazo non é desexable en estudos poboacionais debido á aparición bastante fácil de mutacións de resistencia nas liñas clonais despois da aplicación de funxicidas que conteñen metalaxil- (ou mefenoxam-) no campo. Por exemplo, mostráronse diferenzas significativas no nivel de resistencia dentro da liña clonal Sib1 (Elansky et al., 2001).
Así, o tipo de apareamento, o espectro de isozima da peptidasa, o tipo de ADN mitocondrial, RFLP-RG57, SSR son marcadores preferidos para crear bancos de datos e etiquetar cepas nas coleccións. Para comparar mostras limitadas, se é necesario empregar o número máximo de funcións de marcador, pode usar AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Táboa 5). Non obstante, cómpre lembrar que estes métodos son pouco reproducibles e, en cada experimento individual (ciclo de electroforese de amplificación), hai que empregar varios illados de referencia.
Táboa 5. Comparación de diferentes métodos de investigación de cepas P. infestans
CRITERIO | TC | Policías Isofer | ADNm | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | rotación |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Cantidade de información | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reproducibilidade | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Posibilidade de artefactos | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Custa | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Intensidade laboral | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Velocidade de análise ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Nota: H - baixo, C - medio, B - alto; НС *: a intensidade do traballo é baixa cando se usa xel de agarosa ou automático
xenotipador, medio - por destilación en xel de poliacrilamida con cebadores marcados,
** - sen contar o tempo dedicado ao cultivo de micelio para o illamento do ADN.
Estrutura da poboación
Liñas clonais
A falta de recombinación ou a súa insignificante contribución á estrutura da poboación, a poboación consiste nun certo número de clons, os intercambios xenéticos entre eles son extremadamente raros.
Nestas poboacións, é máis informativo estudar non as frecuencias de xenes individuais, senón as frecuencias de xenotipos que teñen unha orixe común (liñaxes clonais ou liñaxes clonais) e que difiren só por mutacións puntuais. Os estudos poboacionais do patóxeno tizón tardío e a análise das liñas clonais aceleráronse significativamente desde a chegada do método RFLP-RG57 a principios dos anos 90 do século pasado. Xunto con RFLP-RG57, o tipo de apareamento, os espectros da peptidasa e isoenzimas da glicosa-6-fosfato isomerase e o tipo de ADN mitocondrial úsanse para identificar as liñas clonais. As características das liñas clonais máis comúns móstranse na táboa 6.
O clon US-1 dominou as poboacións de todas partes ata finais dos anos oitenta, despois do cal comezou a ser substituído por outros clons e desapareceu de Europa e América do Norte. Agora atópase no Extremo Oriente (Filipinas, Taiwán, China, Xapón, Corea, Koh e col., 80, Mosa e col., 1994), en África (Uganda, Quenia, Ruanda, Goodwin e col., 1993, Vega-Sánchez e col. al., 1994; Ochwo et al., 2000) e en América do Sur (Ecuador, Brasil, Perú, Forbes et al., 2002; Goodwin et al., 1997). Non se identificaron cepas pertencentes á liña US-1994 só en Australia. Ao parecer, os illados de P. infestans chegaron a Australia con outra onda migratoria (Goodwin, 1).
O clon EU-6 migrou do norte de México a California a finais dos anos setenta e causou unha epidemia alí en patacas e tomates despois de 70 anos sen enfermidades. Pola súa alta agresividade, desprazou o clon US-32 e comezou a dominar na costa oeste dos Estados Unidos (Goodwin et al., 1a).
Os xenotipos US-7 e US-8 descubríronse nos Estados Unidos en 1992 e xa en 1994 estaban amplamente distribuídos nos Estados Unidos e Canadá. Durante unha tempada de campo, o clon US-8 é capaz de desprazar case por completo o clon US-1 en parcelas de patacas infectadas inicialmente con ambos clons a igual concentración (Miller e Johnson, 2000).
Os clons BC-1 a BC-4 identificáronse na Columbia Británica nun pequeno número de illados de Goodwin et al., 1995b). O clon US-11 estendeuse amplamente nos Estados Unidos e substituíu a US-1 en Taiwán. Os clons JP-1 e EC-1, xunto co clon US-1, son comúns en Xapón e Ecuador, respectivamente (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 é un clon que prevaleceu en Rusia sobre un vasto territorio desde a rexión de Moscú ata Sahalin. Na rexión de Moscova, descubriuse en 1993 e algunhas poboacións de campo consistían principalmente en cepas desta liña clonal, altamente resistentes ao metalaxilo. Despois de 1993, a prevalencia deste clon diminuíu significativamente. Fóra dos Urais en 1997-1998, atopouse SIB-1 en todas partes, a excepción do Territorio de Khabarovsk (o clon SIB-2 está moi estendido alí). A separación espacial de clons con diferentes tipos de apareamento exclúe o proceso sexual en Siberia e no Extremo Oriente. Na rexión de Moscú, a diferenza de Siberia, a poboación está representada por moitos clons; case todos os illados teñen un xenotipo multilocus único (Elansky et al., 2001, 2015). Esta diversidade non se pode explicar unicamente pola importación de cepas do fungo de diferentes partes do mundo con material de semente importado. Dado que os dous tipos de apareamento ocorren na poboación, é posible que a súa diversidade tamén se deba á recombinación. Así, na Columbia Británica asúmese a aparición dos xenotipos BC-2, BC-3 e BC-4 debido á hibridación dos clons BC-1 e US-6 (Goodwin et al., 1995b). É posible que as cepas híbridas se atopen nas poboacións de Moscova. Por exemplo, as cepas MO-4, MO-8 e MO-11 heterozigotas para o locus PEP poden ser híbridos entre as cepas MO-12, MO-21, MO-22, que teñen o tipo de apareamento A2 e homocigotas para un alelo do locus PEP e a cepa MO-8, que ten o tipo de apareamento A1 e homocigoto para outro alelo do locus. E se este é o caso, e nas poboacións modernas de P. infestans hai unha tendencia a un aumento do papel do proceso sexual, entón o valor da información da análise de clons multilocus diminuirá (Elansky et al., 2001, 2015).
Variación en liñas clonais
Ata os anos 90 do século XX, a liña clonal US-20 estivo estendida no mundo. A maioría das poboacións rexionais e de campo consistían exclusivamente en cepas co xenotipo US-1. Non obstante, tamén se observaron diferenzas entre os illados, moi probablemente causadas por un proceso mutacional. As mutacións producíronse tanto no ADN nuclear como no mitocondrial e afectaron, entre outras cousas, ao nivel de resistencia ás drogas fenilamidas e ao número de xenes de virulencia. As liñas que se diferencian dos xenotipos orixinais por mutacións indícanse mediante números adicionais despois do punto que segue o nome do xenotipo orixinal (por exemplo, a liña mutante US-1 da liña clonal US-1.1). As liñas de ADN de impresión dixital US-1 e US-1.5 conteñen liñas accesorias de diferentes tamaños (Goodwin et al., 1.6a, 1995b); a liña clonal US-1995 tamén difiere de US-6.3 por unha liña accesoria (Goodwin, 6, táboa 1997).
Ao estudar o ADN mitocondrial, descubriuse que só o ADN mitocondrial de tipo 1b se atopa na liña clonal US-1 (Carter et al., 1990). Non obstante, no estudo de cepas desta liñaxe clonal de Perú e Filipinas atopáronse illados cuxos tipos de ADN mitocondrial diferían de 1b en presenza de insercións e delecións (Goodwin, 1991; Koh et al., 1994).
Táboa 6. Xenotipos multilocus dalgunhas liñas clonais de P. infestans
nome | Tipo de apareamento | Isozimas | Pegadas dixitais de ADN | Tipo de ADNm | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Nota: * - sen datos.
Táboa 7. Xenotipos multilocus e as súas liñas mutantes
nome | Tipo de apareamento | | Huellas dixitais de ADN (RG57) | Notas | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Xenotipo orixinal 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutación en PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutación en RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutación en RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutación en RG57 e PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutación en RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Xenotipo orixinal 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutación en PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutación en RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutación en RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutación en RG57 e PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutación en RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Xenotipo orixinal 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutación en RG57 |
Tamén hai cambios nos espectros das isozimas. Como regra xeral, son causadas pola descomposición dun organismo inicialmente heterozigoto para este encima en homocigóticos. En 1993, en froitas de tomate, identificamos unha cepa con características características de US-1: pegada dixital RG57, tipo de ADN mitocondrial e xenotipo 86/100 para glicosa-6-fosfato-isomerase, pero era homocigota (100/100) para o primeiro locus da peptidasa en lugar de un heterozigoto 92/100 típico desta liña clonal. Chamamos o xenotipo desta cepa MO-17 (táboa 6). As liñas mutantes US-1.1 e US-1.4 tamén difiren de US-1 por mutacións no primeiro locus da peptidasa (táboa 7).
As mutacións que provocan cambios no número de xenes de virulencia para as variedades de pataca e tomate son bastante comúns. Notáronse entre os illados da liña clonal US-1 en poboacións dos Países Baixos (Drenth et al., 1994), Perú (Goodwin et al., 1995a), Polonia (Sujkowski et al., 1991), norte de América do Norte (Goodwin et al., ., 1995b). Tamén se observaron diferenzas no número de xenes de virulencia da pataca entre illados das liñas clonais US-7 e US-8 en Canadá e Estados Unidos (Goodwin et al., 1995a), entre illados da liña SIB-1 na parte asiática de Rusia (Elansky et al, 2001 ).
Identificáronse illados con fortes diferenzas nos niveis de resistencia ás drogas fenilamidas en poboacións de campo monoclonais, todas pertencentes á liña clonal Sib-1 (Elansky et al, 2001, táboa 1). Case todas as cepas da liña clonal US-1 son moi susceptibles ao metalaxilo; con todo, illados desta liña resistentes foron illados en Filipinas (Koh et al., 1994) e en Irlanda (Goodwin et al., 1996).
Poboacións modernas de P. infestans
Centroamérica (México)
A poboación de P. infestans en México difire notablemente doutras poboacións mundiais, o que se debe principalmente á súa posición histórica. Numerosos estudos desta poboación e especies relacionadas con P. infestans do clado Phytophthora, así como especies locais do xénero Solanum, levaron á conclusión de que a evolución do patóxeno na parte central de México produciuse xunto coa evolución das plantas hospedadoras e asociouse á recombinación sexual (Grünwald, Flier , 2005). Ambos os tipos de apareamento están representados na poboación, e en proporcións iguais, e a presenza de oosporas no chan, en plantas e tubérculos de patacas e especies silvestres relacionadas con Solanum confirma a presenza dun proceso sexual na poboación (Fernández-Pavía et al., 2002). Estudos recentes do val do Toluca e os seus arredores (o presunto centro de orixe do patóxeno) confirmaron a alta diversidade xenética da poboación local de P. infestans (134 xenotipos multilocus nunha mostra de 176 mostras) e a presenza de varias subpoboacións diferenciadas na rexión (Wang et al., 2017). Os factores que contribúen a esta diferenciación son a división espacial das subpoboacións características das terras altas do centro de México, as diferenzas nas condicións de cultivo e as variedades de pataca empregadas en vales e montañas e a presenza de especies de Solanum tuberosas silvestres que poden actuar como hospedadoras alternativas (Fry et al ., 2009).
Non obstante, cómpre ter en conta que as poboacións de P. infestans no norte de México son de natureza máis clonal e son máis semellantes ás poboacións norteamericanas, o que pode indicar que estes son os novos xenotipos (Fry et al., 2009).
América do Norte
As poboacións norteamericanas de P. infestans sempre tiveron unha estrutura moi sinxela e o seu carácter clonal estableceuse moito antes do uso da análise microsatélite. Ata 1987, a liña clonal US-1 dominaba nos Estados Unidos e Canadá (Goodwin et al., 1995). A mediados dos anos setenta, cando apareceron funxicidas a base de metalaxilo, este clon comezou a ser substituído por outros xenotipos máis resistentes que emigraron desde México (Goodwin et al., 70). A finais dos 1998. o xenotipo US-90 substituíu por completo ao xenotipo US-8 nos Estados Unidos e converteuse na liña clonal dominante das patacas (Fry et al., 1; Fry et al., 2009). A situación era diferente cos tomates, que contiñan constantemente varias liñas clonais, e a súa composición cambiou dun ano a outro (Fry et al., 2015).
En 2009, estalou unha epidemia a gran escala de tizón tardío nos tomates nos Estados Unidos. Unha característica desta pandemia foi a súa aparición case simultánea en moitos lugares do nordeste dos Estados Unidos e resultou estar asociada a vendas masivas de mudas de tomate infectadas en grandes xardíns (Fry et al., 2013). As perdas de colleita foron enormes. A análise por microsatélite das mostras afectadas revelou que a cepa pandémica pertencía á liña clonal de apareamento tipo US-22 A2. En 2009, a cota deste xenotipo na poboación americana de P. infestans alcanzou o 80% (Fry et al., 2013). Nos anos seguintes, a proporción de xenotipos agresivos US-23 (principalmente en tomates) e US-24 (en patacas) aumentou constantemente na poboación, con todo, despois de 2011, a taxa de detección de US-24 diminuíu significativamente e ata a data, aproximadamente o 90% da poboación patóxena en Estados Unidos está representado polo xenotipo US-23 (Fry et al., 2015).
En Canadá, como nos Estados Unidos, a finais dos 90. o xenotipo dominante US-1 foi suplantado por US-8, cuxa posición dominante permaneceu inalterada ata 2008. En 2009-2010. En Canadá, houbo graves epidemias de tizón asociadas á venda de mudas de tomate infectadas, pero foron causadas polos xenotipos US-23 e US-8 (Kalischuk et al., 2012). A clara diferenciación xeográfica destes xenotipos foi notable: Estados Unidos-23 dominou as provincias occidentais de Canadá (68%), mentres que Estados Unidos-8 dominou as provincias orientais (83%). Nos anos seguintes, o EUA-23 estendeuse ás rexións orientais; con todo, en xeral, a súa participación na poboación diminuíu lixeiramente no contexto da aparición dos xenotipos US-22 e US-24 no país (Peters et al., 2014). Ata a data, os EUA-23 manteñen unha posición dominante en todo Canadá; US-8 está presente en Columbia Británica, mentres que US-23 e US-24 están presentes en Ontario (Peters, 2017).
Así, as poboacións norteamericanas de P. infestans son principalmente liñas clonais. Nos últimos 40 anos, o número de xenotipos clonais detectados chegou a 24. A pesar de que as cepas de ambos tipos de apareamento están presentes na poboación, a probabilidade de aparición de novos xenotipos como resultado da recombinación sexual segue sendo bastante baixa. Non obstante, nos últimos 20 anos rexistráronse varios casos de aparición de efémeras poboacións recombinantes (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014) e, nun caso, o resultado do cruzamento foi o xenotipo US-11. , que estivo afincado en América do Norte durante moitos anos (Gavino et al., 2000). Ata 2009, os cambios na estrutura das poboacións asociábanse á aparición de novos xenotipos máis agresivos coa súa posterior migración e desprazamento de predecesores anteriormente dominantes. Que pasou no 2009-2010 en Estados Unidos e Canadá, os epifitóticos demostraron por primeira vez que na era da globalización, os brotes da enfermidade poden asociarse á propagación activa de novos xenotipos ao vender material de plantación infectado.
Sudamérica
Ata hai pouco, os estudos de poboacións sudamericanas de P. infestans non eran regulares nin a grande escala. Sábese que a estrutura destas poboacións é bastante sinxela e inclúe de 1 a 5 liñaxes clonais por país (Forbes et al., 1998). Así, para 1998, os xenotipos US-1 (Brasil, Chile) BR-1 (Brasil, Bolivia, Uruguai, Paraguai), EC-1 (Ecuador, Colombia, Perú e Venezuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 e AR-5 (Arxentina), PE-3 e PE-7 (sur de Perú). O tipo de apareamento A2 estivo presente en Brasil, Bolivia e Arxentina e non se atopou máis alá da fronteira boliviano-peruana na zona do lago Titicaca, detrás da cal o xenotipo EC-1 A1 dominaba nos Andes. En tomates, US-1 seguía sendo o xenotipo dominante en toda Sudamérica.
A situación persistiu máis ou menos na década de 2000. Un punto importante foi o descubrimento nos Andes do Norte sobre os parentes de pataca de crecemento salvaxe (S. brevifolium e S. tetrapetalum) dunha nova liña clonal EC-2 do tipo A2 (Oliva et al., 2010). Os estudos filoxenéticos demostraron que esta liña non é completamente idéntica a P. infestans, aínda que está estreitamente relacionada con ela, nesta conexión propúxose considerala, así como outra liña, EC-3, illada da tomateira S. betaceum que medra nos Andes. unha nova especie chamada P. andina; con todo, o estado desta especie (unha especie independente ou un híbrido de P. infestans con algunha liña aínda descoñecida) aínda non está claro (Delgado et al., 2013).
Actualmente, todas as poboacións sudamericanas de P. infestans son clonais. A pesar da presenza de ambos tipos de apareamento, non se identificaron poboacións recombinantes. No tomate, o xenotipo US-1 é omnipresente, aparentemente desprazado das patacas por cepas locais, cuxa orixe exacta aínda se descoñece. En Brasil, Bolivia e Uruguai está presente o xenotipo BR-1; en Perú, xunto con US-1 e EC-1, hai outros xenotipos locais. Nos Andes, a posición dominante mantense pola liña clonal EC-1, cuxa relación co recentemente descuberto P. andina segue sendo descoñecida. O único lugar "inestable" onde para o período 2003-2013. houbo cambios significativos na poboación, converteuse en Chile (Acuña et al., 2012), onde no 2004-2005. a poboación de patóxenos caracterizouse pola resistencia ao metalaxilo e un novo haplotipo de ADN mitocondrial (Ia en lugar do Ib anteriormente presente). 2006 a 2011 na poboación, dominou o xenotipo 21 (segundo SSR), cuxa porcentaxe alcanzou o 90%, tras o cal a palma pasou ao xenotipo 20, cuxa frecuencia de aparición nos dous anos seguintes mantívose en preto do 67% (Acuña, 2015).
Europa
Na historia de Europa houbo polo menos dúas ondas migratorias de P. infestans desde América do Norte: no século XIX. (HERB-1) e principios do século XX (US-1). A distribución omnipresente de funxicidas que conteñen metalaxilo nos anos 70. levou ao desprazamento do xenotipo dominante US-1 e á súa substitución por novos xenotipos. Como resultado, na maioría dos países de Europa occidental, as poboacións do patóxeno estaban representadas principalmente por varias liñas clonais.
O uso da análise de microsatélites para a análise das poboacións de patóxenos permitiu revelar cambios graves ocorridos en Europa Occidental en 2005-2008. En 2005 descubriuse no Reino Unido unha nova liña clonal, chamada 13_A2 (ou "Azul 13") e caracterizada polo tipo de apareamento A2 , alta agresividade e resistencia ás fenilamidas (Shaw et al., 2007). O mesmo xenotipo atopouse en mostras recollidas en 2004 nos Países Baixos e no norte de Francia, o que suxire que migrou ao Reino Unido desde a Europa continental, posiblemente con patacas de semente (Cooke et al., 2007). O estudo do xenoma de representantes desta liña clonal mostrou un alto grao de polimorfismo da súa secuencia (para 2016, o número das súas variacións subclonais alcanzou os 340) e un significativo grao de variación no nivel de expresión xénica, incl. xenes efectores durante a infección das plantas (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Estas características, xunto cunha maior duración da fase biotrófica, puideron causar unha maior agresividade de 13_A2 e a súa capacidade para infectar incluso variedades de pataca resistentes ao tizón tardío.
Nos próximos anos, o xenotipo estendeuse rapidamente polos países do noroeste de Europa (Gran Bretaña, Irlanda, Francia, Bélxica, Holanda, Alemaña) co desprazamento simultáneo dos xenotipos anteriormente dominantes 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Segundo o sitio web www.euroblight.net, a porción de 13_A2 nas poboacións destes países alcanzou o 60-80% e máis; a presenza deste xenotipo tamén se rexistrou nalgúns países do leste e do sur de Europa. Non obstante, en 2009-2012. 13_A2 perdeu as súas posicións dominantes en Gran Bretaña e Francia, cedendo á liña 6_A1 (8_A1 en Irlanda) e en Holanda e Bélxica foi parcialmente substituído polos xenotipos 1_A1, 6_A1 e 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Ata a data, aproximadamente o 70% da poboación de P. infestans en Europa occidental é monoclonal. Segundo o sitio web www.euroblight.net, os xenotipos dominantes nos países do noroeste de Europa (Reino Unido, Francia,
Holanda, Bélxica) seguen, aproximadamente en proporcións iguais, 13_A2 e 6_A1, este último practicamente non se atopa fóra da rexión especificada (con excepción de Irlanda), pero xa ten polo menos 58 subclons (Cooke, 2017). As variacións 13_A2 están presentes en cantidades notables en Alemaña, e tamén se observan esporadicamente nos países de Europa Central e do Sur. O xenotipo 1_A1 constitúe unha parte significativa das poboacións de Bélxica e parcialmente dos Países Baixos e Francia. O xenotipo 8_A1 estabilizouse na poboación europea no nivel do 3-6%, a excepción de Irlanda, onde mantén a súa posición de liderado e divídese en dous subclons (Stellingwerf, 2017). Finalmente, en 2016, observouse un aumento na frecuencia de aparición de novos xenotipos 36_A2 e 37_A2, rexistrados por primeira vez en 2013-2014; ata a data, estes xenotipos atópanse en Holanda e Bélxica e en parte en Francia e Alemaña, así como na parte sur de Gran Bretaña (Cooke, 2017). Aproximadamente un 20-30% da poboación de Europa occidental está representada por xenotipos únicos cada ano.
A diferenza de Europa occidental, no momento en que apareceu o xenotipo 13_A2, as poboacións do norte de Europa (Suecia, Noruega, Dinamarca, Finlandia) estaban representadas non por liñas clonais, senón por un gran número de xenotipos únicos (Brurberg et al.,
2011). Durante o período de propagación activa de 13_A2 en Europa Occidental, a presenza deste xenotipo en Escandinavia non se observou ata 2011, cando se descubriu por primeira vez no norte de Xutlandia (Dinamarca), onde se cultivan principalmente variedades de pataca industriais co uso activo de metalaxil. funxicidas (Nielsen et al., 2014). Segundo www.euroblight.net, o xenotipo 13_A2 tamén se detectou en varias mostras de Noruega e Dinamarca no 2014 e en varias mostras noruegas no 2016; ademais, en 2013, observouse a presenza do xenotipo 6_A1 nunha pequena cantidade en Finlandia. A principal razón do fracaso de 13_A2 e outras liñas clonais na conquista de Escandinavia considérase que son as diferenzas climáticas desta rexión respecto dos países de Europa occidental.
Ademais do feito de que os veráns frescos e os invernos fríos contribúen á supervivencia das oosporas en lugar do micelio vexetativo (Sjöholm et al., 2013), a conxelación do solo no inverno (que normalmente non ocorre nos países máis cálidos de Europa occidental) contribúe á sincronización da xerminación e plantación das oosporas. patacas, o que mellora o seu papel como fonte de infección primaria (Brurberg et al., 2011). Tamén hai que ter en conta que, nas condicións do norte, o desenvolvemento da infección por oosporas supera o desenvolvemento da infección tuberosa, o que finalmente impide o dominio de liñas clonais aínda máis agresivas, pero posteriormente desenvolvidas (Yuen, 2012). A estrutura das poboacións de P. infestans máis estudadas en Europa do Leste (Polonia, os países bálticos) é moi similar á de Escandinavia.
Os dous tipos de apareamento tamén están presentes aquí e a gran maioría dos xenotipos determinados pola análise SSR son únicos (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Como no norte de Europa, a distribución das liñas clonais (principalmente do xenotipo 13_A2) practicamente non afectou ás poboacións locais do patóxeno, que conservan un alto nivel de diversidade coa ausencia de liñas dominantes pronunciadas.
A presenza de 13_A2 obsérvase ocasionalmente en campos con variedades comerciais de pataca. En Rusia, a situación desenvólvese dun xeito similar. Análise microsatélite de illados de P. infestans recollidos no 2008-2011 en 10 rexións diferentes da parte europea de Rusia, mostraron un alto grao de diversidade xenotípica e unha completa falta de coincidencias coas liñas clonais europeas (Statsyuk et al., 2014). Varios anos despois, un estudo de mostras de P. infestans recollidas na rexión de Leningrado no 2013-2014 mostrou diferenzas significativas entre eles e os xenotipos desta rexión identificados no estudo anterior. En ambos os estudos non se atoparon xenotipos de Europa occidental (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
A alta diversidade xenética das poboacións de P. infestans en Europa do Leste e a ausencia de liñas clonais dominantes nelas poden estar relacionadas con varias razóns. En primeiro lugar, como no norte de Europa, as condicións climáticas dos países considerados contribúen á formación de oosporas como fonte primaria de infección (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). En segundo lugar, unha proporción significativa de patacas producidas nestes países cultívanse en pequenas granxas privadas, moitas veces rodeadas de bosques ou outros obstáculos para a libre circulación de material infeccioso (Chmielarz et al., 2014). Como regra xeral, as patacas cultivadas nestas condicións practicamente non se tratan con produtos químicos e a elección das variedades baséase na súa resistencia ao tizón tardío, é dicir. non hai presión selectiva para a agresividade e resistencia ao metalaxilo, o que priva xenotipos resistentes, como 13_A2, de vantaxes sobre outros xenotipos (Chmielarz et al., 2014). Finalmente, debido ao pequeno tamaño das parcelas, os seus propietarios normalmente non practican a rotación de cultivos, cultivando patacas durante anos no mesmo lugar, o que contribúe á acumulación dun inóculo xeneticamente diverso (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Asia
Ata hai pouco, a estrutura das poboacións de P. infestans en Asia seguía sendo relativamente pouco entendida. Sabíase que está representado principalmente por liñas clonais e o efecto da recombinación sexual na aparición de novos xenotipos é moi pequeno. Así, por exemplo, en 1997-1998. Na parte asiática de Rusia (Siberia e Extremo Oriente), a poboación patóxena só estaba representada por tres xenotipos con predominio do xenotipo SIB-1 (Elansky et al., 2001). A presenza de liñas patóxenas clonais amosouse en países como China, Xapón, Corea, Filipinas e Taiwán (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). A liña clonal US-1 dominou un gran territorio de Asia a finais dos 90 - principios dos 2000. case en todas partes comezou a ser substituído por outros xenotipos, que, á súa vez, deron paso a outros novos. Na maioría dos casos, os cambios na estrutura e composición das poboacións nos países asiáticos asociáronse coa migración de novos xenotipos desde fóra. Así, en Xapón, a excepción do xenotipo JP-3, todos os demais xenotipos xaponeses que apareceron despois de US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) teñen unha orixe externa máis ou menos comprobada (Akino et al., 2011) ... Actualmente hai tres poboacións patóxenas principais en China, que teñen unha clara división xeográfica; Non hai ou hai un fluxo xénico moi feble entre estas poboacións (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). O xenotipo 13_A2 apareceu no territorio de China nas súas provincias do sur (Yunnan e Sichuan) no 2005-2007 e no 2012-1014. tamén se viu no nordeste do país (Li et al., 2013b). Na India, 13_A2 apareceu presuntamente ao mesmo tempo que en China, moi probablemente con patacas de semente infectadas (Chowdappa et al., 2015) e en 2009-2010. causou unha grave epifitose do tizón tardío no tomate no sur do país, tras o cal se estendeu ás patacas e en 2014 causou un brote de tizón tardío en Bengala Occidental, que provocou a ruína e o suicidio de moitos agricultores locais (Fry, 2016).
Африка
Ata 2008-2010 non se realizaron estudos sistemáticos de P. infestans en países africanos. Actualmente, as poboacións africanas de P. infestans pódense dividir en dous grupos, e esta división está claramente asociada ao feito de importar patacas de semente de Europa.
No norte de África, que importa activamente patacas de semente de Europa, o tipo de apareamento A2 está amplamente representado en case todas as rexións, o que proporciona unha posibilidade teórica da aparición de novos xenotipos como resultado da recombinación sexual (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Ademais, en Alxeria, obsérvase a presenza dos xenotipos 13_A2, 2_A1 e 23_A1 cun pronunciado dominio do primeiro deles, así como unha diminución gradual da proporción de xenotipos únicos ata a desaparición completa (Rekad et al., 2017). A diferenza do resto da rexión, en Tunisia (a excepción do nordeste do país), a poboación patóxena está representada principalmente polo tipo de apareamento A1 (Harbaoui et al., 2014).
Aquí a liña clonal NA-01 é dominante. En xeral, a proporción de liñas clonais na poboación é só do 43%. En África oriental e austral, onde o volume de importacións de sementes é moi pequeno (Fry et al., 2009), P. infestans só está representada por dúas liñas clonais de tipo A1, US-1 e KE-1, e a segunda despraza activamente ás primeiras polas patacas ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). Ata a data, estes dous xenotipos teñen un número notable de variacións subclonais.
Australia
O primeiro informe de tizón tardío nas patacas en Australia remóntase a 1907 e a primeira epifitotia, presuntamente causada por fortes choivas nos meses de verán, produciuse en 1909-1911. (Drenth et al., 2002). Non obstante, en xeral, o tizón tardío non ten significación económica significativa para o país. Os brotes esporádicos de tizón tardío, provocados por condicións meteorolóxicas que proporcionan alta humidade, non se producen máis dunha vez cada 5-7 anos e localízanse principalmente no norte de Tasmania e no centro de Victoria. En relación co anterior, as publicacións dedicadas ao estudo da estrutura da poboación australiana de P. infestans están practicamente ausentes. A información máis recente dispoñible é de 1998-2000. (Drenth et al., 2002). Segundo os autores, a poboación de Victoria era unha liña clonal US-1.3, o que confirmou indirectamente a migración deste xenotipo dos Estados Unidos. Os exemplares de Tasmania clasificáronse como AU-3, diferentes dos xenotipos presentes nese momento noutras partes do mundo.
Características do desenvolvemento do tizón tardío en Rusia
En Europa, considérase como o principal inóculo das patacas unha infección introducida con tubérculos de sementes enfermos, oosporas que invernan no chan, así como zoosporangia provocada polo vento procedente de plantas cultivadas a partir de tubérculos invernados nos campos do ano pasado (plantas "voluntarias"), ou en montóns de animais sacrificados. marcador para o almacenamento de tubérculos. Destas, as plantas cultivadas en moreas de tubérculos descartados son consideradas a fonte de infección máis perigosa. alí, o número de tubérculos xermolados é a miúdo significativo e a zoosporangia pódese transportar deles a longas distancias. O resto das fontes (oosporas, plantas "voluntarias") non son tan perigosas, porque non é habitual cultivar plantas nos mesmos campos máis veces que unha vez cada 3-4 anos. A infección por tubérculos de sementes enfermos tamén é mínima debido a un bo sistema de control de calidade das sementes.
En xeral, a cantidade de inóculo nas poboacións europeas é limitada e, polo tanto, o aumento da epidemia é bastante lento e pódese controlar con éxito empregando preparados funxicidas químicos. A principal tarefa nas condicións europeas é a loita contra a infección na fase en que comeza a dispersión masiva de zoosporangia das plantas afectadas.
En Rusia, a situación é radicalmente diferente. A maior parte do cultivo de pataca e tomate cultívase en pequenos xardíns privados; ou tampouco se levan a cabo medidas de protección ou se realizan tratamentos funxicidas nun número insuficiente e comezan despois da aparición do tizón tardío nas cimas. Como resultado, as hortas privadas actúan como a principal fonte de infección, desde onde o vento leva a zoosporangia ás plantacións comerciais. Isto confírmano as nosas observacións directas en rexións de Moscova, Bryansk, Kostroma e Ryazan: obsérvanse danos ás plantas nos xardíns privados incluso antes do inicio dos tratamentos funxicidas das plantacións comerciais. Posteriormente, a epidemia en grandes campos queda restrinxida polo uso de preparados funxicidas, mentres que nos xardíns privados hai un rápido desenvolvemento do tizón tardío.
No caso de tratamentos impropios ou "orzamentarios" de plantacións comerciais, tamén aparecen focos de tizón tardío nos campos; máis tarde están desenvolvéndose activamente, cubrindo áreas cada vez máis grandes (Elansky, 2015). A infección nos xardíns privados está a ter un impacto significativo nas epidemias nos campos comerciais. En todas as rexións cultivadoras de patacas de Rusia, a superficie ocupada polas patacas nos xardíns privados é varias veces maior que a superficie total dos campos de grandes produtores. En tal ambiente, as hortas privadas pódense ver como un recurso de inóculo global para campos comerciais. Tentemos identificar aquelas propiedades que son características dos xenotipos das cepas nos xardíns privados.
Plantar control de sementes e corentena de patacas de consumo, sementes de tomate obtidas de dubidosos produtores estranxeiros, cultivo a longo prazo de patacas e tomates nas mesmas zonas, tratamentos funxicidas inadecuados ou a súa completa ausencia provocan graves epifitóticos no sector privado, o resultado é gratuíto cruzamento, hibridación e formación de oosporas en xardíns privados. Como resultado, obsérvase unha moi alta diversidade xenotípica do patóxeno, cando case todas as cepas son únicas no seu xenotipo (Elansky et al., 2001, 2015). A plantación de patacas de semente de varias orixes xenéticas fai improbable que aparezan liñas clonais especializadas en atacar calquera variedade. As cepas seleccionadas nese caso distínguense pola súa versatilidade en relación ás variedades afectadas, a maioría delas teñen un número próximo ao máximo de xenes de virulencia. Isto é moi diferente ao sistema de "liñas clonais" típico para grandes campos de empresas agrícolas cun sistema de protección debidamente instalado contra o tizón tardío. As "liñas clonais" (cando todas as cepas do patóxeno do tizón tardío no campo están representadas por un ou máis xenotipos) son omnipresentes en países onde o cultivo de pataca se realiza exclusivamente por grandes granxas: Estados Unidos, Holanda, Dinamarca, etc. En Inglaterra, Irlanda, Polonia, onde as parcelas domésticas tamén están tradicionalmente estendidas no cultivo da pataca, tamén hai unha maior diversidade xenotípica nos xardíns privados. A finais do século XX, as liñas clonais estaban estendidas nas partes asiáticas e do Extremo Oriente de Rusia (Elansky et al., 20), o que aparentemente se debe ao uso das mesmas variedades de patacas exclusivamente para plantar. Recentemente, a situación nestas rexións tamén comezou a cambiar cara a un aumento da diversidade xenotípica das poboacións.
A falta de tratamentos intensivos con preparados funxicidas ten outra consecuencia directa: non hai acumulación de cepas resistentes nos xardíns. De feito, os nosos resultados mostran que as cepas resistentes ao metalaxil atópanse significativamente con menos frecuencia nos xardíns privados que nas plantacións comerciais.
A estreita proximidade das plantacións de patacas e tomates, típicas para xardíns privados, facilita a migración de cepas entre estes cultivos, como resultado da cal, na última década, entre as cepas illadas das patacas, a proporción de cepas que transportan o xene para a resistencia ás variedades de tomate cherry (T1), anteriormente característica só para " cepas de tomate. As cepas co xene T1 na maioría dos casos son moi agresivas tanto cara ás patacas coma aos tomates.
Nos últimos anos, o tizón tardío no tomate comezou a aparecer en moitos casos antes que nas patacas. As mudas de tomate poden estar infestadas por oosporas no chan ou por unhas esporas presentes nas sementes de tomate ou adheridas a elas (Rubin et al., 2001). Nos últimos 15 anos apareceron nas tendas un gran número de sementes empaquetadas económicas, principalmente importadas, e a maioría dos pequenos produtores pasaron a usalas. As sementes poden traer cepas con xenotipos típicos das rexións do seu cultivo. No futuro, estes xenotipos inclúense no proceso sexual nos xardíns privados, o que leva á aparición de xenotipos completamente novos.
Así, pódese afirmar que os xardíns privados son un "crisol" global no que, como resultado do intercambio de material xenético, se procesan os xenotipos existentes e aparecen outros completamente novos. Ademais, a súa selección ten lugar en condicións moi diferentes ás creadas para as patacas en grandes explotacións: a ausencia de prensa funxicida, a uniformidade varietal das plantacións, o predominio de plantas afectadas por diversas formas de infección viral e bacteriana, a proximidade a tomates e solanáceas salvaxes, o cruzamento activo e a formación de esporas, para que as oosporas actúen como fonte de infección para o próximo ano.
Todo isto leva a unha elevada diversidade xenotípica de poboacións de xardíns. Nas condicións de epifitóticos nas hortas, o tizón tardío esténdese moi rapidamente e liberan grandes cantidades de esporas, voando cara ás plantacións comerciais próximas. Non obstante, ao entrar nos campos comerciais co sistema correcto de tecnoloxía agrícola e protección química, as esporas que chegaron non teñen practicamente ningunha oportunidade de iniciar epifitóticos no campo, o que se debe á ausencia de liñas clonais resistentes aos funxicidas e especializadas para a variedade cultivada.
Outra fonte de inóculo primario poden ser os tubérculos enfermos atrapados en mudas comerciais. Estes tubérculos cultiváronse, por regra xeral, en campos con boa tecnoloxía agrícola e protección química intensiva. Os xenotipos dos illados que infectan os tubérculos adáptanse ao desenvolvemento da súa propia variedade. Estas cepas son significativamente máis perigosas para a plantación comercial que o inóculo procedente de xardíns privados. Os resultados da nosa investigación tamén apoian esta suposición. As poboacións illadas de grandes campos con protección química correctamente conducida e boa tecnoloxía agrícola non difiren na alta diversidade xenotípica. A miúdo trátase de varias liñas clonais que son moi agresivas.
As cepas de sementes comerciais poden entrar en poboacións de horta e involucrarse nos procesos que nelas se producen. Non obstante, nunha horta, a súa competitividade será moito menor que nun campo comercial e pronto deixarán de existir en forma de liña clonal, pero os seus xenes pódense empregar na poboación de "xardíns".
A infección que se desenvolve en plantas "voluntarias" e en montóns de tubérculos sacrificados durante a colleita non é tan relevante para Rusia, porque Nas principais rexións de cultivo de pataca de Rusia obsérvase unha profunda conxelación do solo invernal e raramente se desenvolven plantas de tubérculos que invernaron no chan. Ademais, como demostran os nosos experimentos, o patóxeno do tizón tardío non sobrevive a temperaturas negativas nin sequera en tubérculos que mantiveron a súa viabilidade. Na zona árida, onde se practica o cultivo de patacas temperás, o tizón tardío é bastante raro debido á estación de crecemento seca e quente.
Así, actualmente estamos observando a división das poboacións de P. infestans en poboacións de "campo" e "xardín". Non obstante, nos últimos anos observáronse procesos que conducen á converxencia e interpenetración de xenotipos destas poboacións.
Entre eles, pódese notar un aumento xeral da alfabetización de pequenos produtores, a aparición de pequenos paquetes accesibles de patacas de semente, a propagación de preparados funxicidas en pequenos paquetes e a perda do medo á "química" por parte da poboación.
Xorden situacións cando, grazas á vigorosa actividade dun provedor, se plantan aldeas enteiras con tubérculos de sementes da mesma variedade e provén de pequenos paquetes dos mesmos pesticidas. Pódese supor que as patacas da mesma variedade atoparanse nas plantacións comerciais próximas.
Por outra banda, algunhas empresas comerciantes de pesticidas están a promover esquemas de tratamento químico "orzamentarios". Neste caso, o número de tratamentos recomendados está subestimado e ofrécense funxicidas máis baratos e non se fai fincapé en evitar o desenvolvemento do tizón tardío ata a sega das copas, senón nalgún atraso no epifitotipo para aumentar o rendemento. Estes esquemas están economicamente xustificados cando se cultivan patacas de mercancía a partir de sementes de baixa calidade, cando en principio non hai dúbida de obter un alto rendemento. Non obstante, neste caso, a diferenza das poboacións de xardín, o fondo xenético nivelado da pataca contribúe á selección de razas fisiolóxicas específicas, que son moi perigosas para esta variedade.
En xeral, as tendencias cara á converxencia de métodos de "xardín" e "campo" de produción de patacas parécennos bastante perigosas. Para evitar as súas consecuencias negativas, tanto no sector doméstico como no comercial, será necesario controlar tanto a variedade de patacas de semente como a gama de funxicidas ofrecidos a propietarios privados en pequenos envases, así como o seguimento dos esquemas de protección da pataca e o uso de preparados funxicidas no sector comercial.
Nas áreas do sector privado, hai un intenso desenvolvemento non só de tizón tardío, senón tamén de Alternaria. A maioría dos propietarios de parcelas privadas non toman medidas especiais para protexerse contra Alternaria, confundindo o desenvolvemento de Alternaria co marchitamento natural das cimas ou o desenvolvemento do tizón tardío. Polo tanto, co desenvolvemento masivo de Alternaria en variedades susceptibles, as parcelas domésticas poden servir como fonte de inóculo para plantacións comerciais.
Mecanismos de variabilidade
Proceso de mutación
Dado que a aparición de mutacións é un proceso aleatorio que procede cunha baixa frecuencia, a aparición de mutacións en calquera locus depende da frecuencia de mutación deste locus e do tamaño da poboación. Ao estudar a frecuencia das mutacións das cepas de P. infestans, adóitase determinar o número de colonias cultivadas en medios selectivos de nutrientes despois do tratamento con mutaxénicos químicos ou físicos. Como se pode ver nos datos presentados na táboa 8, a frecuencia de mutación da mesma cepa en loci diferentes pode diferir por varias ordes de magnitude. A alta frecuencia de mutacións na resistencia ao metalaxilo pode ser unha das razóns da acumulación de cepas resistentes a ela na natureza.
A frecuencia de mutacións espontáneas ou inducidas, calculada en base a experimentos de laboratorio, non sempre se corresponde cos procesos que ocorren en poboacións naturais, polos seguintes motivos:
1. Con fisións nucleares asíncronas, é imposible estimar a frecuencia de mutacións por unha xeración nuclear. Polo tanto, a maioría dos experimentos proporcionan información só directamente sobre a frecuencia das mutacións, sen distinguir entre dous sucesos mutacionais e un suceso despois da mitose.
2. As mutacións dun só paso adoitan reducir o equilibrio do xenoma, polo que, xunto coa adquisición dunha nova propiedade, diminúe a aptitude xeral do organismo. A maioría das mutacións obtidas experimentalmente teñen unha agresividade reducida e non se rexistran en poboacións naturais. Así, o coeficiente de correlación entre o grao de resistencia dos mutantes de P. infestans aos funxicidas fenilamidas e a taxa de crecemento nun medio artificial foi de media (-0,62) e a resistencia aos funxicidas e á agresividade nas follas da pataca (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), que indica a baixa aptitude dos mutantes. As mutacións de resistencia ao dimetomorfo tamén foron acompañadas dunha forte diminución da viabilidade (Bagirova et al., 2001).
3. A maioría das mutacións espontáneas e inducidas son recesivas e non se manifestan fenotípicamente en experimentos, senón que constitúen unha reserva oculta de variabilidade nas poboacións naturais. As cepas mutantes illadas en experimentos de laboratorio levan mutacións dominantes ou semidominantes (Kulish e Dyakov, 1979). Ao parecer, a diploidía nuclear explica intentos sen éxito de obter mutantes baixo a influencia da irradiación UV que son virulentos en variedades previamente resistentes (McKee, 1969). Segundo os cálculos do autor, tales mutacións poden producirse cunha frecuencia inferior a 1: 500000. A transición de mutacións recesivas a un estado homocigoto, expresado fenotípicamente, pode producirse debido á recombinación sexual ou asexual (ver máis abaixo). Non obstante, incluso neste caso, a mutación pode ser enmascarada polos alelos dominantes dos núcleos de tipo salvaxe no micelio cenótico (multinucleado) e fixada fenotípicamente só durante a formación de zoosporas mononucleares.
Táboa 8. Frecuencia de mutacións de P. infestans en substancias que inhiben o crecemento baixo a acción da nitrosometilurea (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Conexión | Frecuencia de mutación |
Oxitetraciclina | 6,9 10 x-8 |
Blasticidina S | 7,2 x 10-8 |
Estreptomicina | 8,3 x10-8 |
Tricotecina | 1,8 10 x-8 |
Cicloheximida | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimetomorfo | 6,3 10 x-7 |
Metalaxil | 6,9 10 x-6 |
O tamaño da poboación tamén xoga un papel decisivo na aparición de mutacións espontáneas. En poboacións moi grandes, nas que o número de células N> 1 / a, onde a é a taxa de mutación, a mutación deixa de ser un fenómeno aleatorio (Kvitko, 1974).
Os cálculos mostran que cunha infestación media dun campo de patacas (35 manchas por planta), fórmanse diariamente 8x1012 esporas nunha hectárea (Dyakov e Suprun, 1984). Ao parecer, estas poboacións conteñen todas as mutacións permitidas polo tipo de intercambio en cada locus. Incluso unha rara mutación, que se produce cunha frecuencia de 10 a 9, será adquirida por mil individuos dos millóns que viven nunha hectárea dun campo de patacas. Para as mutacións que se producen cunha frecuencia máis alta (por exemplo, 10-6), nunha poboación deste tipo poden producirse varias mutacións diarias (simultaneamente en dous loci), é dicir. o proceso de mutación substituirá á recombinación.
Migracións
Para P. infestans coñécense dous tipos principais de migración: pechar distancias (dentro dun campo de patacas ou campos veciños) estendendo zoosporangia por correntes de aire ou spray de choiva e a longas distancias - con plantación de tubérculos ou froitas de tomate transportadas. O primeiro método garante a expansión do foco da enfermidade, o segundo: a creación de novos focos en lugares afastados do primario.
A propagación da infección por tubérculos e froitos de tomate non só contribúe á aparición da enfermidade en novos lugares, senón que tamén é a principal fonte de diversidade xenética nas poboacións. Na rexión de Moscova cultívanse patacas traídas de diferentes rexións de Rusia e Europa Occidental. Os froitos do tomate tráense das rexións do sur de Rusia (rexión de Astrakhan, territorio de Krasnodar, norte do Cáucaso). As sementes de tomate, que tamén poden servir como fontes de infección (Rubin et al., 2001), tamén se importan das rexións do sur de Rusia, China, países europeos e outros países.
Segundo os cálculos de E. Mayr (1974), os cambios xenéticos nunha poboación local causados por mutacións raramente superan os 10-5 por locus, mentres que nas poboacións abertas, o intercambio debido ao contracorrente de xenes é de polo menos 10-3 - 10-4.
A migración en tubérculos infectados é responsable da entrada de P. infestans a Europa, estendéndose a todas as rexións do mundo onde se cultiva pataca; provocaron os cambios poboacionais máis graves. O tizón tardío nas patacas apareceu no territorio do Imperio ruso case simultaneamente á súa aparición en Europa occidental.
Dado que a enfermidade se observou por primeira vez en 1846-1847 nos Estados bálticos e só nos anos seguintes estendeuse en Bielorrusia e as rexións do noroeste de Rusia, a súa orixe en Europa occidental é obvia. A primeira fonte de tizón no Vello Mundo non é tan obvia. A hipótese desenvolvida por Fry et al. (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995; Goodwin et al., 1994) suxire que o parasito veu primeiro de México a América do Norte, onde se estendeu por cultivos e despois foi transportado a Europa occidental. (fig. 7).
Como resultado da deriva repetida (dobre efecto do "pescozo de botella"), os clons individuais chegaron a Europa, cuxa descendencia causou unha pandemia en todo o territorio do Vello Mundo, onde se cultivan patacas. Como evidencia desta hipótese, os autores citan, en primeiro lugar, a omnipresencia dun só tipo de apareamento (A1) e, en segundo lugar, a homoxeneidade dos xenotipos das cepas estudadas de diferentes rexións (todas elas están baseadas en marcadores moleculares, incluíndo 2 loci de isozima, patróns de pegadas dixitais de ADN e a estrutura do ADN mitocondrial é idéntica e corresponde ao clon US-1 descrito nos EUA). Non obstante, algúns datos xeran dúbidas sobre polo menos algunhas das disposicións da hipótese declarada. A análise do ADN mitocondrial de P. infestans illado de mostras de pataca de herbario infectadas durante o primeiro período epifitótico da década de 40 mostrou que difiren na estrutura do ADN mitocondrial do clon US-1, que, polo tanto, era polo menos non a única fonte de infección en Europa (Ristaino et al, 2001).
A situación do tizón tardío empeorou de novo nos anos 80 do século XX. Os seguintes cambios producíronse:
1) A agresividade media da poboación aumentou, o que provocou, en particular, a propagación xeneralizada da forma máis prexudicial do tizón tardío: danos nos pecíolos e talos.
2) Houbo un cambio no tempo do tizón tardío nas patacas - de finais de xullo a principios de xullo e incluso a finais de xuño.
3) O tipo de apareamento A2, que antes estaba ausente no Vello Mundo, converteuse en omnipresente.
Os cambios foron precedidos por dous acontecementos: o uso masivo do novo funxicida metalaxyl (Schwinn e Staub, 1980) e a aparición de México como exportador mundial de patacas (Niederhauser, 1993). De acordo con isto, presentáronse dúas razóns para os cambios poboacionais: a conversión do tipo de apareamento baixo a influencia do metalaxilo (Ko, 1994) e a introdución masiva de novas cepas con tubérculos infectados de México (Fry e Goodwin, 1995). Aínda que as interconversións de tipos de apareamento baixo a influencia do metalaxilo non só as obtivo Ko, senón tamén en traballos realizados no laboratorio da Universidade Estatal de Moscova (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), é preferible a segunda hipótese. Xunto coa aparición do segundo tipo de apareamento, producíronse cambios serios nos xenotipos das cepas rusas de P. infestans, incluíndo en xenes neutros (isozima e locus RFLP), así como na estrutura do ADN mitocondrial. O complexo destes cambios non se pode explicar pola acción do metalaxil; máis ben, houbo unha importación masiva de novas cepas de México, que, sendo máis agresivas (Kato et al., 1997), desprazaron as cepas antigas (US-1), converténdose en dominante nas poboacións. O cambio na composición das poboacións europeas produciuse en moi pouco tempo - de 1980 a 1985 (Fry et al., 1992). No territorio da antiga URSS, atopáronse "novas cepas" en coleccións de Estonia en 1985, é dicir, antes que en Polonia e Alemaña (Goodwin et al., 1994). A última vez que a "vella cepa US-1" en Rusia foi illada dun tomate infectado na rexión de Moscova en 1993 (Dolgova et al., 1997). Tamén en Francia, atopáronse cepas "vellas" nas plantacións de tomate ata principios dos anos 90, é dicir, despois de que desapareceran moito tempo nas patacas (Leberton e Andrivon, 1998). Os cambios nas cepas de P. infestans afectaron a moitos trazos, incluídos os de gran importancia práctica, e aumentaron a nocividade do tizón tardío.
Recombinación sexual
Para que a recombinación sexual contribúa á variabilidade, é necesario, en primeiro lugar, a presenza de dous tipos de apareamento na poboación nunha proporción próxima a 1: 1 e, en segundo lugar, a presenza da variabilidade poboacional inicial.
A proporción de tipos de apareamento varía moito en diferentes poboacións e incluso en anos diferentes nunha poboación (táboa 9,10, 90). Descoñécense as razóns destes cambios drásticos nas frecuencias dos tipos de apareamento nas poboacións (como, por exemplo, en Rusia ou en Israel a principios dos 2002 do século pasado), pero crese que isto se debe á introdución de clons máis competitivos (Cohen, XNUMX).
Algúns datos indirectos indican o curso do proceso sexual en determinados anos e en certas rexións:
1) Os estudos de poboacións da rexión de Moscova mostraron que en 13 poboacións nas que a participación do tipo de apareamento A2 era inferior ao 10%, a diversidade xenética total calculada para tres loci de isozima foi de 0,08 e en 14 poboacións nas que a participación de A2 superou 30%, a diversidade xenética foi o dobre de alta (0,15) (Elansky et al., 1999). Así, canto maior sexa a probabilidade de relacións sexuais, maior será a diversidade xenética da poboación.
2) A relación entre a relación dos tipos de apareamento nas poboacións e a intensidade da formación de oosporas observouse en Israel (Cohen et al., 1997) e en Holanda
(Flier et al., 2004). Os nosos estudos demostraron que, nas poboacións nas que os illados co tipo de apareamento A2 representaban o 62, 17, 9 e 6%, as oosporas atopáronse no 78, 50, 30 e 15% das follas de pataca analizadas (con 2 ou máis manchas), respectivamente.
As mostras con 2 ou máis manchas contiñan significativamente máis frecuentemente oosporas que as mostras con 1 mancha (32 e 14% das mostras, respectivamente) (Apryshko et al., 2004).
As ósporas eran moito máis comúns nas follas da capa media e inferior da planta da pataca (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) Nalgunhas rexións descubríronse xenotipos únicos, cuxa aparición está asociada á recombinación sexual. Así, en Polonia en 1989 e en Francia en 1990, cepas homocigotas para a glicosa-6-
fosfato isomerase (GPI 90/90). Dado que antes só se atoparon heterozigotos 10/90 durante 100 anos, a homocigosidade atribúese á recombinación sexual (Sujkowski et al., 1994). En Colombia (Estados Unidos), os illados que combinan A2 con GPI 100/110 e A1 con GPI 100/100 son comúns, con todo, ao final da tempada de 1994 (16 de agosto e 9 de setembro), cepas con xenotipos recombinantes (A1 GPI 100/110 e A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) Nalgunhas poboacións de Polonia (Sujkowski et al., 1994) e do Cáucaso do Norte (Amatkhanova et al., 2004), a distribución de loci de ADN de pegadas dixitais e loci de proteínas alozima corresponde á distribución de Hardy-Weinberg, que indica
sobre a elevada cota da contribución da recombinación sexual á variabilidade das poboacións. Noutras rexións de Rusia, non se atopou correspondencia coa distribución de Hardy-Weinberg nas poboacións, pero amosouse a presenza do desequilibrio da ligazón, o que indica o predominio da reprodución clonal (Elansky et al., 1999).
5) A diversidade xenética (GST) entre cepas con diferentes tipos de apareamento (A1 e A2) foi menor que entre diferentes poboacións (Sujkowski et al., 1994), o que indica indirectamente cruzamentos sexuais.
Ao mesmo tempo, a contribución da recombinación sexual á diversidade poboacional non pode ser moi elevada. Esta contribución calculouse para as poboacións da rexión de Moscova (Elansky et al., 1999). Segundo os cálculos de Lewontin (1979), "a recombinación, que pode producir novas variantes a partir de dous loci cunha frecuencia que non supera o produto das súas heterocigose, faise efectiva só se os valores de heterocigose para ambos os alelos xa son altos".
Coa relación dos dous tipos de emparellamento, que é típica para a rexión de Moscova, igual a 4: 1, a frecuencia de recombinación é de 0,25. A probabilidade de que as cepas cruzadas sexan heterocigotas para dous dos tres loci isozigotos estudados nas poboacións estudadas foi de 0,01 (2 cepas de 177). Polo tanto, a probabilidade de aparición de heterocigotos dobres como resultado da recombinación non debe superar o seu produto multiplicado pola probabilidade de cruce (0,25x0,02x0,02) = 10-4, é dicir. os recombinantes sexuais normalmente non caen na mostra estudada de cepas. Estes cálculos fixéronse para as poboacións da rexión de Moscova, que se caracterizan por unha variabilidade relativamente alta. En poboacións monomorfas como as siberianas, o proceso sexual, aínda que se produza en poboacións individuais, non pode influír na súa diversidade xenética.
Ademais, P. infestans caracterízase por frecuentes desalineamientos cromosómicos na meiose, o que leva á aneuploidía (Carter et al., 1999). Estas violacións reducen a fertilidade dos híbridos.
Recombinación parasexual, conversión de xenes mitóticos
En experimentos sobre a fusión de cepas de P. infestans con mutacións de resistencia a diferentes inhibidores do crecemento, atopouse a aparición de misolatos resistentes a ambos inhibidores (Shattock e Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). As cepas resistentes a dous inhibidores do crecemento xurdiron como resultado da heterocariotización do micelio e, neste caso, fendéronse durante a reprodución por zoosporas mononucleares (Judelson, Ge Yang, 1998), ou non fendéronse en descendencia monozoospora, porque tiñan núcleos tetraploides (xa que os illados iniciais son diploides) (K , 1979). Os diploides heterocigotos segregáronse a unha frecuencia moi baixa debido á haploidización, á non disxunción do cromosoma e ao cruzamento mitótico (Poedinok et al., 1982). A frecuencia destes procesos podería aumentar coa axuda de certas accións sobre diploides heterozigotos (por exemplo, irradiación UV de esporas xerminativas).
Aínda que a formación de híbridos vexetativos con dobre resistencia non só se produce in vitro, senón tamén en tubérculos de pataca infectados cunha mestura de mutantes (Kulish et al., 1978), é bastante difícil avaliar o papel da recombinación parasexual na xeración de novos xenotipos nas poboacións. A frecuencia de formación de segregantes debido á haploidización, a non disxunción dos cromosomas e o cruzamento mitótico sen efectos especiais é insignificante (menos de 10-3).
A aparición de segregantes homocigotos de cepas heterozigotas pode basearse tanto no cruzamento mitótico como na conversión xénica mitótica, que en P. sojae ocorre cunha frecuencia de 3 x 10-2 a 5 x 10-5 por locus, dependendo da cepa (Chamnanpunt et al. , 2001).
Aínda que a frecuencia de aparición de heterocarións e diploides heterozigotos resultou ser inesperadamente alta (alcanzando decenas de por cento), este proceso só ocorre cando se empalman cultivos mutantes obtidos da mesma cepa. Cando se usan diferentes cepas illadas da natureza, non se produce heterocariotización (ou ocorre cunha frecuencia moi baixa) debido á presenza de incompatibilidade vexetativa (Poedinok e Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). En consecuencia, o papel da recombinación parasexual só pode reducirse á recombinación intraclonal en núcleos heterocigotos e á transición de xenes individuais a un estado homocigoto sen un proceso sexual. Este proceso pode ter unha importancia epidemiolóxica en cepas con mutacións de resistencia ao funxicida recesivas ou semi-dominantes. A súa transición a un estado homocigoto debido ao proceso parasexual aumentará a resistencia do portador da mutación (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgresión de xenes
As especies heterotálicas Phytophthora son capaces de cruzarse coa formación de oosporas híbridas (ver Vorob'eva e Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). O híbrido natural das dúas especies de Phytophthora foi tan agresivo que matou miles de ameneiros no Reino Unido (Brasier et al., 1999). P. infestans pode ocorrer con outras especies do xénero (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, etc.) en plantas hóspede comúns e no solo, pero hai pouca información na literatura sobre a posibilidade de híbridos interespecíficos. En condicións de laboratorio, obtivéronse híbridos entre P. infestans e P. Mirabilis (Goodwin e Fry, 1994).
Táboa 9. A proporción de cepas de P. infestans con tipo de apareamento A2 en diferentes países do mundo no período de 1990 a 2000 (segundo os datos de fontes e sitios de literatura aberta www.euroblight.net, www.eucablight.org)
País | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Bielorrusia | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Bélxica | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ecuador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estonia | 8 (12) | ||||||||||
Inglaterra | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finlandia | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Francia | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Hungría | 72 (32) | ||||||||||
Irlanda | 4 (145) | ||||||||||
Norte. Irlanda | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Holanda | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Норвегия | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Perú | 0 (34, 1984-86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Польша | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Escocia | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Швеция | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Gales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Corea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
China | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Colombia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Marruecos | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
México (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Táboa 10. A proporción de cepas de P. infestans con tipo de apareamento A2 en diferentes países do mundo no período 2000 a 2011
País | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Austria | 65 (83) | ||||||||||
Bielorrusia | 42 (78) | ||||||||||
Bélxica | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Suíza | 89 (19) | ||||||||||
Чехия | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Alemaña | 95 (53) | ||||||||||
Dinamarca | 48 (52) | ||||||||||
Ecuador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estonia | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Inglaterra | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finlandia | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Francia | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Hungría | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Norte. Irlanda | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Holanda | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Норвегия | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Perú | 0 (36) | ||||||||||
Польша | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Escocia | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Швеция | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Eslovaquia | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Gales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Corea | 46 (26) | ||||||||||
Brasil | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
China | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dinámica da composición xenotípica das poboacións
Os cambios na composición xenotípica das poboacións de P. infestans poden ocorrer baixo a influencia da migración de novos clons doutras rexións, as prácticas agrícolas (cambio de variedades, aplicación de funxicidas) e as condicións meteorolóxicas. As influencias externas afectan de xeito diferente aos clons en diferentes etapas do ciclo de vida; polo tanto, as poboacións experimentan anualmente cambios cíclicos nas frecuencias dos xenes suxeitos a selección, debido a un cambio no papel dominante da deriva e selección dos xenes.
Influencia da variedade
As novas variedades con xenes eficaces para a resistencia vertical (xenes R) son un poderoso factor selectivo, seleccionando clons con xenes de virulencia complementarios nas poboacións de P. infestans. En ausencia de resistencia inespecífica na variedade de patacas, que inhibe o crecemento da poboación patóxena, o proceso de cambio dos clons dominantes na poboación prodúcese moi rápido. Así, despois da propagación na rexión de Moscova da variedade Domodedovsky, que ten o xene de resistencia R3, a frecuencia dos clons virulentos desta variedade aumentou de 0,2 a 0,82 nun ano (Dyakov e Derevjagina, 2000).
Non obstante, o cambio nas frecuencias dos xenes de virulencia (patotipos) nas poboacións prodúcese non só baixo a influencia das variedades de pataca cultivadas. Por exemplo, en Bielorrusia ata 1977 dominaron os clons con xenes de virulencia 1 e 4, o que foi causado polo cultivo de variedades de patacas con xenes de resistencia R1 e R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Non obstante, a finais dos anos 70 do século XX, apareceron clons con diferentes xenes de virulencia e as súas combinacións, e os xenes de resistencia complementarios nunca se empregaron na cría de patacas (xenes de extra virulencia) (Ivanyuk et al., 2002). O motivo da aparición destes clons, ao parecer, débese á migración a Europa de material infeccioso de México con tubérculos de pataca. Na casa, estes clons desenvolvéronse non só en patacas cultivadas, senón tamén en especies salvaxes que portan unha variedade de xenes de resistencia; polo tanto, a combinación de moitos xenes de virulencia no xenoma era necesaria para a supervivencia nesas condicións.
En canto ás variedades con resistencia inespecífica, ao reducir a taxa de reprodución do patóxeno, atrasan a evolución das súas poboacións, o que, como xa se mencionou, é unha función do número. Dado que a agresividade é polixénica, os clons que conteñen un maior número de xenes para a "agresividade" acumúlanse canto antes canto maior sexa o tamaño da poboación. Polo tanto, as razas moi agresivas non son un produto de adaptación a variedades cultivadas con resistencia inespecífica, senón que, pola contra, son máis propensas a ser detectadas nas plantacións de variedades altamente susceptibles que son acumuladoras das esporas do parasito.
Así, en Rusia, as poboacións máis agresivas de P. Infestans atopáronse nas zonas de epifitotías anuais (poboacións das rexións de Sakhalin, Leningrado e Bryansk). A agresividade destas poboacións resultou ser superior á das mexicanas (Filippov et al., 2004).
Ademais, fórmanse menos oosporas nas follas de variedades resistentes que nas susceptibles (Hanson e Shattock, 1998), é dicir, a resistencia inespecífica da variedade tamén reduce as capacidades de recombinación do parasito e a posibilidade de métodos alternativos de invernada.
Influencia dos funxicidas
Os funxicidas non só reducen o número de fungos fitopatóxenos, é dicir. afectan ás características cuantitativas das súas poboacións, pero tamén poden cambiar as frecuencias dos xenotipos individuais, é dicir. inflúen na composición cualitativa das poboacións. Entre os indicadores máis importantes de poboacións que cambian baixo a influencia de funxicidas están os seguintes: cambios na resistencia aos funxicidas, cambios na agresividade e virulencia e cambios nos sistemas de reprodución.
Influencia dos funxicidas na resistencia e agresividade das poboacións
O grao desta influencia vén determinado, en primeiro lugar, polo tipo de funxicida empregado, que pode dividirse condicionalmente en polisita, oligosita e monosita.
O primeiro inclúe a maioría dos funxicidas de contacto. A resistencia a eles (se é posible) está controlada por un gran número de xenes moi débilmente expresivos. Estas propiedades determinan a ausencia de cambios visibles na resistencia da poboación despois do tratamento con funxicidas (aínda que nalgúns experimentos obtívose certo aumento da resistencia). A poboación de fungos conservada despois da pulverización con funxicidas de contacto consta de dous grupos de cepas:
1) Cepas conservadas en zonas de plantas non tratadas coa droga. Como non houbo contacto co funxicida, a agresividade e resistencia destas cepas non cambia.
2) Cepas en contacto co funxicida, cuxa concentración nos puntos de contacto foi inferior á letal. Como se mencionou anteriormente, a resistencia desta parte da poboación tampouco cambia, sen embargo, debido ao efecto prexudicial parcial do funxicida incluso na concentración subletal sobre o metabolismo da célula fúngica, o estado físico xeral e o seu compoñente parasito, a agresividade, diminúe (Derevyagina e Dyakov, 1990).
Así, incluso unha parte da poboación que non morreu, exposta ao contacto co funxicida, ten unha feble agresividade e non pode ser unha fonte de epifitóticos. Polo tanto, un procesamento coidadoso, que reduce a frecuencia da proporción da poboación que non está en contacto co funxicida, é unha condición para o éxito das medidas de protección. A resistencia aos funxicidas oligosíticos está controlada por varios xenes aditivos.
A mutación de cada xene leva a un certo aumento da resistencia e o grao xeral de resistencia débese á adición de tales mutacións. Polo tanto, o aumento da resistencia prodúcese por pasos. Un exemplo de aumento gradual da resistencia son as mutacións na resistencia ao funxicida dimethomorfo, que se usa amplamente para protexer as patacas contra o tizón tardío. A resistencia ao dimetomorfo é polixénica e aditiva. A mutación dun paso aumenta lixeiramente a resistencia.
Cada mutación posterior diminúe o tamaño do obxectivo e, en consecuencia, a frecuencia das mutacións posteriores (Bagirova et al., 2001). O aumento da resistencia media da poboación despois de múltiples tratamentos con funxicida oligosita prodúcese gradualmente e gradualmente. A velocidade deste proceso está determinada por polo menos tres factores: a frecuencia de mutación dos xenes de resistencia, o coeficiente de resistencia (a relación da dose letal dunha cepa resistente en relación a unha sensible) e o efecto das mutacións nos xenes de resistencia sobre a forma física.
A frecuencia de aparición de cada mutación posterior é inferior á anterior; polo tanto, o proceso ten unha natureza amortecedora (Bagirova et al., 2001). Non obstante, se os procesos de recombinación (sexuais ou parasexuais) ocorren nunha poboación, entón é posible combinar diferentes mutacións parentais nunha cepa híbrida e acelerar o proceso. Polo tanto, as poboacións de panmix adquiren resistencia máis rápido que as agámicas e, neste último, as poboacións que non teñen barreiras de incompatibilidade vexetativa máis rápido que as poboacións divididas por tales barreiras. Neste sentido, a presenza de cepas en poboacións que difiren nos tipos de apareamento acelera o proceso de adquisición de resistencia aos funxicidas oligosíticos.
O segundo e terceiro factores non contribúen á rápida acumulación de cepas resistentes a dimetomorfos nas poboacións. Cada mutación posterior duplica aproximadamente a resistencia, o que é insignificante e, ao mesmo tempo, reduce tanto a velocidade de crecemento nun ambiente artificial como a agresividade (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Quizais por iso non hai practicamente cepas resistentes entre as cepas naturais de P. infestans, incluso as recollidas en plantacións de pataca tratadas con dimetomorfo.
Unha poboación tratada cun funxicida oligosita tamén constará de dous grupos de cepas: as que non estiveron en contacto co funxicida e, polo tanto, non cambiaron as características iniciais (se se atopan cepas resistentes entre este grupo, non se acumularán debido á maior agresividade e competitividade das cepas sensibles), e cepas en contacto con concentracións subletais do funxicida. Entre estes últimos é posible a acumulación de cepas resistentes, porque aquí teñen vantaxes sobre as sensibles.
Polo tanto, cando se usan funxicidas oligosíticos, non é tan importante un tratamento exhaustivo como unha alta concentración do fármaco, varias veces superior á dose letal, porque coa mutaxénese por etapas a resistencia inicial das cepas mutadas é baixa.
Finalmente, as mutacións na resistencia aos funxicidas monosíticos son moi expresivas, é dicir, unha mutación pode reportar un alto nivel de resistencia ata a completa perda de sensibilidade. Polo tanto, o aumento da resistencia das poboacións prodúcese moi rápido.
Un exemplo destes funxicidas son as fenilamidas, incluído o funxicida máis común metalaxyl. As mutacións de resistencia a ela xorden cunha frecuencia elevada e o grao de resistencia nos mutantes é moi alto: supera a cepa sensible nun factor de mil ou máis (Derevyagina et al., 1993). Aínda que a taxa de crecemento e a agresividade dos mutantes resistentes diminúe no contexto da morte de cepas susceptibles dun funxicida sistémico, o número da poboación resistente está crecendo rapidamente e a súa agresividade aumenta paralelamente. Polo tanto, despois de varios anos empregando o funxicida, a agresividade das cepas resistentes non só pode igualar a agresividade das sensibles, senón tamén superala (Derevyagina, Dyakov, 1992).
Impacto na recombinación sexual
Dado que a aparición frecuente do tipo de apareamento A2 nas poboacións de P. infestans coincidiu co uso intensivo de metalaxilo contra o tizón tardío, supúxose que o metalaxilo induce a conversión do tipo de apareamento. En P. parasitica, tal conversión baixo a acción de Chloroneb e metalaxyl demostrouse experimentalmente (Ko, 1994). Un único paso nun medio cunha baixa concentración de metalaxilo provocou a aparición de illados homotálicos dunha cepa de P. infestans sensible ao metalaxilo con tipo de apareamento A1 (Savenkova e Cherepnikova-Anikina, 2002). Durante as pasaxes posteriores en medios cunha maior concentración de metalaxilo, non se detectou nin un illado do tipo de emparellamento A2, con todo, a maioría dos illados, cando se cruzaron con illados A2, en vez de oosporas, formaron acumulacións de micelio feos e foron estériles. As pasaxes dunha cepa resistente con tipo de apareamento A2 en medios cunha alta concentración de metalaxilo revelaron tres formas de cambios de tipo de apareamento: 1) esterilidade completa cando se cruza cos illados A1 e A2; 2) homotallismo (a formación de oosporas no monocultivo); 3) conversión do tipo de apareamento A2 a A1. Así, o metalaxil pode causar cambios nos tipos de apareamento nas poboacións de P. infestans e, en consecuencia, a aparición de recombinación sexual nelas.
Efectos sobre a recombinación vexetativa
Algúns xenes de resistencia aos antibióticos aumentaron a frecuencia da heterocariotización hifal e da diploidización nuclear (Poedinok e Dyakov, 1981). Como se sinalou anteriormente, a heterocariotización das hifas durante a fusión de diferentes cepas de P. infestans ocorre moi raramente debido ao fenómeno da incompatibilidade vexetativa neste fungo. Non obstante, os xenes de resistencia a algúns antibióticos poden ter efectos secundarios, expresados na superación da incompatibilidade vexetativa. Esta propiedade era posuída polo xene de resistencia á estreptomicina mutante 1S-1. A presenza destes mutantes nas poboacións de fitophthora pode aumentar o fluxo de xenes entre cepas e acelerar a adaptación de toda a poboación a novas variedades ou funxicidas.
Certos funxicidas e antibióticos poden afectar a frecuencia da recombinación mitótica, que tamén pode alterar as frecuencias do xenotipo nas poboacións. O funxicida benomilo moi utilizado únese á beta-tubulina, unha proteína a partir da cal se constrúen microtúbulos do citoesqueleto e perturba así os procesos de separación dos cromosomas na anafase da mitose, aumentando a frecuencia da recombinación mitótica (Hastie, 1970).
O funxicida para-fluorofenilalanina, usado para tratar a enfermidade holandesa en olmos, ten a mesma propiedade. A para-fluorofenilalanina tamén aumentou a frecuencia de recombinación en diploides heterozigotos P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Cambios cíclicos na composición xenotípica das poboacións no ciclo vital de P. infestans
O ciclo de desenvolvemento clásico de P. infestans na zona temperada consta de 4 fases.
1) Fase de crecemento exponencial da poboación (fase policíclica) con xeracións curtas. Esta fase comeza normalmente en xullo e dura 1,5-2 meses.
2) A fase de deter o crecemento da poboación debido a unha forte diminución da proporción de tecido non afectado ou a aparición de condicións meteorolóxicas desfavorables. Esta fase nas explotacións que levan a cabo a eliminación precoz das follas cae do ciclo anual.
3) A fase de invernada en tubérculos, acompañada dunha diminución significativa do tamaño da poboación debido á infección accidental de tubérculos, o desenvolvemento lento da infección neles, a ausencia de reinfección de tubérculos, a podremia e a eliminación de tubérculos afectados en condicións normais de almacenamento.
4) A fase de desenvolvemento lento no chan e nas mudas (fase monocíclica), na que a duración da xeración pode chegar a un mes ou máis (finais de maio - principios de xullo). Normalmente neste momento, as follas enfermas son difíciles de detectar incluso con observacións especiais.
Fase de crecemento exponencial da poboación (fase policíclica)
Numerosas observacións (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) demostraron que ao comezo do epifitotipo predominan os clons pouco virulentos e lixeiramente agresivos, que posteriormente son substituídos por outros máis virulentos e agresivos. a taxa de crecemento da agresividade da poboación é maior, menos resistente é a variedade da planta hóspede.
A medida que a poboación crece, aumenta a concentración de xenes importantes selectivamente introducidos en variedades comerciais (R1-R4) e selectivamente neutros (R5-R11). Así, nas poboacións próximas a Moscova en 1993, a virulencia media de finais de xullo a mediados de agosto aumentou de 8,2 a 9,4 e o maior aumento observouse no xene de virulencia selectivamente neutro R5 (do 31 ao 86% dos clons virulentos) (Smirnov, 1996 ).
Unha diminución da taxa de crecemento dunha poboación vai acompañada dunha diminución da actividade parasitaria da poboación. Polo tanto, nos anos depresivos, tanto o número total de razas como a proporción de razas altamente virulentas son máis baixos que nos epifitóticos (Borisenok, 1969). Se á altura da epifitótica as condicións meteorolóxicas pasan a ser desfavorables para o tizón tardío e diminúe a infestación de patacas, tamén diminúe a concentración de clons altamente virulentos e agresivos (Rybakova et al., 1987).
O aumento das frecuencias dos xenes que afectan á virulencia e á agresividade da poboación pode deberse á selección de clons máis virulentos e agresivos na poboación mixta. Para demostrar a selección, desenvolveuse un método para a análise de mutacións neutras, que se utilizou con éxito en poboacións de quimostatos de fermento (Adams et al., 1985) e Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
A frecuencia de mutantes resistentes á blasticidina S na poboación de campo de P. infestans diminuíu en paralelo co crecemento da agresividade da poboación, o que indica un cambio nos clons dominantes durante o crecemento da poboación (Rybakova et al., 1987).
Fase de invernada en tubérculos
Durante o inverno nos tubérculos da pataca, a virulencia e a agresividade das cepas de P. infestans diminúen e a diminución da virulencia prodúcese máis lentamente que a agresividade (Rybakova e Dyakov, 1990). Ao parecer, en condicións propicias para o rápido crecemento do tamaño da poboación (selección r), os xenes de virulencia "extra" e a alta agresividade son útiles, polo tanto, o desenvolvemento de epifitóticos vai acompañado da selección dos clons máis virulentos e agresivos. En condicións de saturación do ambiente, cando non a taxa de reprodución, senón a persistencia da existencia en condicións desfavorables (selección K) xogan un papel importante, os xenes "extra" de virulencia e agresividade reducen o estado físico e os clons con estes xenes son os primeiros en extinguirse, de xeito que a agresividade media e a virulencia da poboación está caendo.
Fase de vexetación no solo
Esta fase é a máis misteriosa do ciclo de vida (Andrivon, 1995). A súa existencia postulouse puramente especulativamente - debido á falta de información sobre o que lle ocorre ao patóxeno durante un longo período (ás veces máis dun mes) - desde a aparición de mudas de pataca ata a aparición das primeiras manchas da enfermidade. En base a observacións e experimentos, reconstruíuse o comportamento do fungo neste período da vida (Hirst e Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
A esporulación do fungo pode formarse nos tubérculos infectados no chan. As esporas resultantes xerminan con hifas, que poden vexetar durante moito tempo no chan. As esporas primarias (formadas en tubérculos) e secundarias (no micelio do solo) ascenden á superficie do solo por correntes capilares, pero adquiren a capacidade de infectar patacas só despois de que as follas inferiores descendan e entren en contacto coa superficie do solo. Tales follas (nomeadamente as primeiras manchas da enfermidade que se atopan nelas) non se forman inmediatamente, senón despois dun prolongado crecemento e desenvolvemento de tapas de pataca.
Así, a fase de vexetación saprotrófica tamén pode existir no ciclo de vida de P. infestans. Se na fase parasitaria do ciclo de vida a agresividade é o compoñente máis importante da aptitude, entón na fase sapotrófica a selección ten como obxectivo reducir as propiedades parasitarias, como se demostrou experimentalmente para algúns fungos fitopatóxenos (ver Carson, 1993). Polo tanto, nesta fase do ciclo, as propiedades agresivas deberíanse perder de forma máis intensa. Pero ata agora non se realizaron experimentos directos para confirmar os supostos anteriores.
Os cambios estacionais afectan non só ás propiedades patóxenas de P. infestans, senón tamén á resistencia aos funxicidas, que medra na fase policíclica (durante as epifitotías) e diminúe durante o almacenamento invernal (Derevyagina et al., 1991; Kadish e Cohen, 1992). Observouse unha caída particularmente intensa da resistencia ao metalaxilo entre a plantación dos tubérculos afectados e a aparición das primeiras manchas da enfermidade no campo.
Especialización intraespecífica e a súa evolución
P. infestans está a causar epidemias en dous cultivos de importancia comercial, a pataca e o tomate. As epifitotias en patacas comezaron pouco despois de que o fungo entrase en novas áreas. A derrota do tomate tamén se observou pouco despois da aparición da infección nas patacas, pero as epifitotías no tomate só se notaron cen anos despois, a mediados do século XX. Isto é o que escriben Hallegli e Niederhauser sobre a derrota dos tomates nos Estados Unidos
(1962): “Durante uns 100 anos despois do grave período epifitótico de 1845, poucos ou case ningún intento de obter variedades resistentes de tomate. Aínda que o tizón tardío rexistrouse nos tomates xa en 1848, non chegou a ser obxecto de atención seria dos criadores desta planta ata un forte brote da enfermidade en 1946. No territorio de Rusia rexistrouse o tizón tardío do tomate no século XIX. “Durante moito tempo, os investigadores non prestaron atención a esta enfermidade, xa que non causou danos económicos importantes. Pero nos anos 60 e 70. Na Unión Soviética tamén se observan epifitotías do tizón tardío do século XX, principalmente na rexión do Baixo Volga, en Ucraína, no Cáucaso do Norte, en Moldavia ... ”(Balashova, 1979).
Desde entón, o tizón de tomate por tizón converteuse en anual, estendeuse por todo o territorio do cultivo industrial e doméstico e causa un enorme dano económico a esta colleita. Que pasou? Por que a primeira aparición do parasito nas patacas e a lesión epifitótica deste cultivo ocorreu case simultaneamente e por que pasou un século para que o epifitótico aparecese no tomate? Estas diferenzas soportan unha fonte de infección mexicana e non sudamericana. Se a especie Phytophthora infestans formouse como un parásito das especies mexicanas do xénero Solanum, entón compréndese por que as patacas cultivadas pertencentes á mesma sección do xénero que as especies mexicanas foron tan fortemente afectadas, pero debido á ausencia de coevolución co parasito, que non desenvolveu mecanismos de resistencia específica e inespecífica.
O tomate pertence a unha sección diferente do xénero, o tipo de intercambio presenta diferenzas significativas respecto das especies tuberosas, polo tanto, a pesar de que o tomate non está fóra da especialización alimentaria de P. infestans, a intensidade do seu dano foi insuficiente para producir graves perdas económicas.
A aparición de epifitotías nun tomate débese a graves cambios xenéticos no parasito, que aumentaron a súa forma física (patoxenicidade) durante o parasitismo. Cremos que a nova forma especializada para parasitar o tomate é a raza T1 descrita por M. Gallegly, que afecta ás variedades de tomate cherry (Red Cherry, Ottawa), resistente á raza T0 estendida nas patacas (Gallegly, 1952). Ao parecer, unha mutación (ou unha serie de mutacións) que converteu a carreira T0 na carreira T1 e provocou a aparición de clons moi adaptados para derrotar o tomate. Como adoita suceder, un aumento da patoxenicidade para un hóspede foi acompañado da súa diminución para outro, é dicir, xurdiu unha especialización intraespecífica inicial, aínda non completa, para as patacas (raza T0) e para o tomate (raza T1).
Cal é a evidencia desta suposición?
- Ocorrencia en patacas e tomates. Nas follas de tomate predomina a raza T1, mentres que nas follas de pataca é rara. Segundo S.F. Bagirova e T.A. Oreshonkova (inédito) na rexión de Moscova en 1991-1992, a aparición da raza T1 nas plantacións de patacas foi do 0% e nas de tomate - 100%; en 1993-1995 - 33% e 90%, respectivamente; en 2001 - 0% e 67%. Datos similares obtivéronse en Israel (Cohen, 2002). Os experimentos coa infección de tubérculos de pataca con illados da raza T1 e unha mestura de illados T0 e T1 mostraron que os illados da raza T1 están mal conservados nos tubérculos e son substituídos por illados da raza T0 (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dinámica da raza T1 nas plantacións de tomate. A infección primaria das follas de tomate lévana a cabo por illados da raza T0, que dominan na análise da infección nas primeiras manchas formadas nas follas. Isto confirma o esquema xeralmente aceptado da migración de parasitos: a masa principal de infección por patacas prodúcese pola raza T0, con todo, un pequeno número de clons T1 conservados nas patacas, unha vez sobre o tomate, desprazan a raza T0 e acumúlanse cara ao final do período epifitótico. Tamén é posible que haxa unha fonte alternativa de infección das follas de tomate coa raza T1, que non é tan potente como os tubérculos e as follas da pataca, pero si. Polo tanto, esta fonte ten un efecto débil sobre a estrutura xenética da poboación que infecta o tomate, pero posteriormente determina a acumulación da raza T1 (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Agresividade ás patacas e aos tomates. A infección artificial de tomate e follas de pataca con illados das razas T0 e T1 mostrou que os primeiros son máis agresivos para as patacas que para o tomate e os segundos son máis agresivos para o tomate que para a pataca. Estas diferenzas maniféstanse no desprazamento de illados dunha raza non "propia" dunha poboación mixta durante os pasos de follas nun invernadoiro (D'yakov et al., 1975) e en parcelas de campo (Leberton et al., 1999); diferenzas na carga infecciosa mínima, período de latencia, tamaño das manchas infecciosas e produción de esporas (Rybakova, 1988; Dyakov e col., 1994; Legard e col., 1995; Forbes e col., 1997; Oyarzun e col., 1998; Leberton e col. , 1999; Vega-Sánchez e outros, 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna e outros, 2004).
A agresividade dos illados da raza T1 ás variedades de tomate que carecen de xenes de resistencia é tan elevada que estes illados esporan nas follas como nun medio nutritivo sen necrotizar o tecido infectado (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Virulencia para patacas e tomates. A raza T1 afecta ás variedades de tomate cherry co xene de resistencia Ph1, mentres que a raza T0 non é capaz de infectar estas variedades, é dicir. ten unha virulencia máis estreita. En relación aos diferenciadores
Os xenes R das patacas están inversamente relacionados, é dicir. as cepas illadas das follas de tomate son menos virulentas que as cepas de "pataca" (táboa 11).
5) Marcadores neutros. A análise de marcadores neutros nas poboacións de P. infestans parasitándose en patacas e tomates tamén testemuña a selección intraespecífica multidireccional. Nas poboacións brasileiras de P. infestans, os illados de follas de tomate pertencían á liña clonal US-1 e os das follas de pataca pertencían á liña BR-1 (Suassuna et al., 2004). En Florida (EE. UU.), Desde 1994, o clon US-90 comezou a dominar sobre as patacas (cunha aparición de máis do 8%), e os clons US-11 e US-17 sobre o tomate, e os illados deste último son máis agresivos para o tomate que para a pataca (Weingartner , Tombolato, 2004). Establecéronse diferenzas significativas nas frecuencias do xenotipo (pegadas dixitais de ADN) nos illados de pataca e tomate para 1200 cepas de P. infestans recollidas nos Estados Unidos de 1989 a 1995 (Deahl et al., 1995).
O método AFLP permitiu separar 74 cepas recollidas de follas de pataca e tomate en 1996-1997. en Francia e Suíza, en 7 grupos. As cepas de pataca e tomate non diferían claramente, pero as cepas de "pataca" eran xeneticamente máis diversas que as de "tomate". Os primeiros atopáronse nos sete grupos e os segundos, só en catro, o que indica un xenoma máis especializado do segundo (Knapova e Gisi, 2002).
6) Mecanismos de illamento. Se as poboacións do parasito en dúas especies vexetais hóspede evolucionan cara ao estreitamento da especialización ao seu propio hóspede, entón xorden varios mecanismos pre e postmeióticos que impiden os intercambios xenéticos interpoboacionais (Dyakov e Lekomtseva, 1984).
Varios estudos investigaron o efecto da fonte de cepas parentais sobre a eficiencia da hibridación. Ao cruzar cepas illadas de diferentes especies do xénero Solanum en Ecuador (Oliva et al., 2002), comprobouse que as cepas con tipo de apareamento A2 de Solanaceae salvaxe (liña clonal EC-2) son as peor cruzadas con cepas de tomate (liña EC -3), e máis eficazmente cruzada coa cepa de pataca (EC-1).
Comprobouse que todos os híbridos non eran patóxenos. Os autores cren que a baixa porcentaxe de hibridación e a redución da patoxenicidade nos híbridos débense a mecanismos posmeióticos de illamento reprodutivo das poboacións.
Nos experimentos de Bagirova et al. (1998), cruzáronse un gran número de cepas de pataca e tomate coas propiedades das razas T0 e T1. Os cruzamentos máis fértiles de cepas T1xT1 illadas do tomate (36 oosporas no campo visual do microscopio, o 44% da xerminación das oosporas), as menos efectivas foron as cruzamentos de razas T0xT1 illadas de diferentes hóspedes (un número baixo de oosporas en desenvolvemento e xerminadas, unha alta proporción de oosporas abortivas e subdesenvolvidas) ... A eficiencia dos cruzamentos entre illados da raza T0 illados das patacas foi intermedia. Dado que o corpo principal de cepas da raza T0 afecta ás patacas, ten unha fonte fiable de invernada: os tubérculos de pataca, como resultado da cal a importancia das oosporas como unidades infecciosas invernantes para as poboacións de patacas é baixa. A "forma de tomate" adaptada pode invernar no tomate en forma de oosporas (ver máis abaixo) e, polo tanto, mantén unha maior produtividade do proceso sexual. Debido á súa alta fertilidade, o T1 adquire un potencial independente de infección primaria no tomate. Os resultados obtidos por Knapova et al. (Knapova et al., 2002) pódense interpretar do mesmo xeito. As cruces de cepas illadas de patacas con cepas de tomate deron o maior número de oosporas: 13,8 por mm cadrado. medio (cunha propagación de 5-19) e unha porcentaxe intermedia de xerminación de oosporas (6,3 cunha propagación de 0-24). Os cruzamentos de cepas illadas a partir de tomate deron a porcentaxe máis baixa de oosporas (7,6 cunha extensión de 4-12) coa maior porcentaxe de xerminación (10,8). Os cruzamentos entre as cepas illadas das patacas deron un número intermedio de oosporas (8,6 cunha alta dispersión de datos - 0-30) e a porcentaxe máis baixa de xerminación de oosporas (2,7). Así, as cepas das patacas son menos fértiles que as do tomate, pero os cruzamentos entre poboacións non deron peores resultados que os das intrapoboacións. É posible que as diferenzas cos datos anteriores de Bagirova et al. explícanse o feito de que os investigadores rusos traballaron con cepas illadas a principios dos 90 do século XX e os investigadores suízos - con cepas illadas a finais dos 90.
A base para unha baixa fertilidade pode ser a heteroploidía das cepas. Se nas poboacións mexicanas, onde o proceso sexual e a infección primaria con descendencia de oosporas son regulares, a maioría das cepas estudadas de P. Infestans son diploides, entón nos países do Vello Mundo obsérvase polimorfismo de ploidía intrapopulación (cepas di-, tri- e tetraploides, así como cepas heterocariotas con núcleos heteroploides) , e cepas que teñen diferentes tipos de apareamento, é dicir. mutuamente fértiles, difiren na ploidía nuclear (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). A diversidade de núcleos en antheridia e oogonia pode ser o motivo da baixa fertilidade.
En canto aos intercambios nucleares entre hifas durante as anastomoses, isto impídese pola incompatibilidade vexetativa, que divide as poboacións asexuais en moitos clons xeneticamente illados (Poedinok e Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Converxencia de poboacións. Os datos anteriores indican que é posible a hibridación entre as cepas de "pataca" e "tomate" de P. infestans. Tamén é posible a reinfección recíproca de diferentes hóspedes, aínda que con menor agresividade.
Un estudo de marcadores de poboación en illados de campos de pataca e tomate adxacentes en 1993 mostrou que aproximadamente a cuarta parte dos illados illados de follas de tomate foron transferidos dun campo de pataca veciño (Dolgova et al., 1997). Teoricamente, podería supoñerse que a diverxencia de poboacións en dous hóspedes aumentaría e levaría á aparición de formas intraespecíficas especializadas (f.sp. patata e f.sp. tomate), especialmente porque as oosporas poden persistir nos restos vexetais (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) e sementes de tomate (Rubin et al., 2001). En consecuencia, os tomates teñen actualmente unha fonte de rexeneración primaveral independente dos tubérculos da pataca.
Non obstante, todo sucedeu doutro xeito. A invernada con oosporas permitiu ao parasito evitar a etapa máis estreita do seu ciclo de vida: a etapa monocíclica da vexetación no chan, durante a cal diminúen as propiedades parasitarias que se restauran gradualmente na fase policíclica no verán.
Táboa 11. Frecuencias dos xenes de virulencia a variedades diferenciadoras de pataca en cepas de P. infestans
País | Ano | Número medio de xenes de virulencia en cepas | Autor | |
de patacas | de tomate | |||
Francia | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et al., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Francia, Suíza | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
EUA | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et al., 1995 |
EUA, Zap. Washington DC | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ecuador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et al., 1998 |
Israel | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rusia, Mosk. rexión | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Rusia, distintas rexións | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya e outros. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
A zoosporangia primaria e as zoosporas, que xerminan oosporas, teñen un alto grao de actividade parasitaria, especialmente se as oosporas formáronse partenoxeneticamente baixo a influencia de feromonas dunha cepa co tipo oposto de apareamento. Polo tanto, o material infeccioso das mudas de tomate cultivadas a partir de sementes infectadas con oosporas é altamente patóxeno tanto para o tomate como para a pataca.
Estes cambios levaron a outra reestruturación da poboación, expresada nos seguintes cambios importantes desde o punto de vista epidemiolóxico:
- As mudas de tomate infectadas convertéronse nunha importante fonte de infección primaria das patacas (Filippov, Ivanyuk, mensaxes persoais).
- As epifitotías nas patacas comezaron a observarse xa en xuño, aproximadamente un mes antes do habitual.
- Nas plantacións de patacas aumentou a porcentaxe da raza T1, que previamente se atopaba alí nunha cantidade insignificante (Ulanova et al., 2003).
- As cepas illadas das follas de tomate xa non diferían das cepas de pataca en virulencia nos diferenciadores de patacas de xenes de virulencia e comezaron a superar as cepas de "pataca" en agresividade non só no tomate, senón tamén nas patacas (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
Así, en vez de diverxencia, houbo unha converxencia de poboacións, o xurdimento dunha única poboación en dúas plantas hospedadoras con alta virulencia e agresividade para ambas especies.
Conclusión
Así, a pesar de máis de 150 anos de estudo intensivo de P. infestans, en bioloxía, incluída a bioloxía poboacional deste axente causante das enfermidades máis importantes das plantas solanáceas cultivadas, aínda se descoñece moito. Non está claro como afecta o paso das etapas individuais do ciclo de vida á estrutura das poboacións, cales son os mecanismos xenéticos da variabilidade canalizada da agresividade e virulencia, cal é a relación dos sistemas reprodutivos reprodutivos e clonais nas poboacións naturais, como se herda a incompatibilidade vexetativa, cal é o papel das patacas e os tomates na infección primaria destes cultivos e en cal é o seu efecto na estrutura poboacional do parasito. Ata agora non se resolveron cuestións prácticas tan importantes como os mecanismos xenéticos para cambiar a agresividade do parasito ou a erosión da resistencia inespecífica á pataca. Co afondamento e expansión da investigación sobre o tizón tardío da pataca, o parasito supón novos retos para os investigadores. Non obstante, a mellora das capacidades experimentais, a aparición de novos enfoques metodolóxicos para a manipulación con xenes e proteínas permítennos esperar unha solución exitosa das preguntas formuladas.
O artigo publicouse na revista "Potato Protection" (no 3, 2017)